為建立牛布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法,本研究以牛種布魯氏菌B. abortus2308基因組為模板,PCR擴(kuò)增其HSP70基因,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-HSP70,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并純化,SDS-PAGE結(jié)果顯示,得到重組HSP70蛋白,HSP70主要以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)條件優(yōu)化建立以該蛋白為包被抗原的間接ELISA(iELISA)方法,結(jié)果顯示,iELISA最佳反應(yīng)條件為:抗原HSP70包被濃度為0.2μg/孔,血清稀釋度為1200,封閉液為5%脫脂奶粉,兔抗牛IgG-HRP稀釋度為14 000,顯色10 min;該iELISA方法的臨界值為0.186。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,除布魯氏菌病陽(yáng)性血清外,該iELISA與IBR、BVD和FMD陽(yáng)性血清無(wú)明顯交叉反應(yīng);敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,血清1400稀釋時(shí)仍能有效檢出布魯氏菌;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示。批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10%,重復(fù)性好。利用本實(shí)驗(yàn)建立的iELISA方法與傳統(tǒng)的虎紅凝集和試管凝集試驗(yàn)同時(shí)對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè),比分析檢測(cè)結(jié)果,結(jié)果顯示該iELISA方法與其它兩者符合率較高。利用本方法對(duì)秦皇島未進(jìn)行布魯氏菌病免疫的規(guī)模...

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料
    1.2 重組表達(dá)載體和表達(dá)菌株的構(gòu)建
    1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)
    1.4 檢測(cè)牛布魯氏菌抗體的iELISA方法的優(yōu)化
    1.5 i ELISA方法臨界值（CUT OFF）的確定
    1.6 iELISA方法的特異性試驗(yàn)
    1.7 i ELISA方法的敏感性試驗(yàn)
    1.8 iELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn)
    1.9 與經(jīng)典方法的比較及初步應(yīng)用試驗(yàn)
2 結(jié)果
    2.1 HSP70基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET32a-HSP70鑒定
    2.2 重組蛋白的表達(dá)、鑒定及純化
    2.3 iELISA方法的優(yōu)化結(jié)果
    2.4 臨界值的確定
    2.5 iELISA方法的特異性分析
    2.6 iELISA的敏感性分析
    2.7 iELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn)
    2.8 與經(jīng)典方法的比較及初步應(yīng)用
3 討論



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