豬附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生于豬紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓,引起不明原因的發(fā)熱、黃疸、貧血等癥狀的一種人獸共患傳染病。由于動物感染附紅細(xì)胞體帶來的危害日益嚴(yán)重,受到了各國的普遍關(guān)注,尤其在近幾年給我國的畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。目前,該病沒有標(biāo)準(zhǔn)的免疫控制方法和特效治療藥物,所因此,建立一種適合于臨床快速診斷出該病的檢測方法,減少該病對人畜的健康危害,對該病的控制及預(yù)防都具有重要意義。本研究依據(jù)GenBank發(fā)布的豬附紅細(xì)胞體Eno基因序列,設(shè)計(jì)合成一對特異性引物,在引物的上下游5’端分別標(biāo)記上生物素(BIOT)和地高辛(DIG),擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物。按照PCR-ELISA方法操作,通過優(yōu)化包被液種類、包被液濃度、結(jié)合抗體的反應(yīng)條件、封閉條件、PCR產(chǎn)物稀釋度及顯色時間等,確定最優(yōu)條件。通過檢測的30份陰性樣本的OD值計(jì)算本研究建立的PCR-ELISA方法的臨界值。通過檢測豬附紅細(xì)胞體基因組DNA梯度稀釋的OD值,測定該方法敏感性。通過擴(kuò)增豬附紅細(xì)胞體、豬鏈球菌、豬大腸桿菌、豬肺炎支原體、弓形蟲及健康豬血基因DNA片段,檢測所建立PCE-ELISA方法的特異性。通過對同一批次、不同批次包...

【文章頁數(shù)】：40 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
    1 附紅細(xì)胞體病的概述
        1.1 病原學(xué)
        1.2 流行病學(xué)
        1.3 危害
    2 診斷方法的研究進(jìn)展
        2.1 直接鏡檢法
        2.2 血清學(xué)診斷法
        2.3 分子生物學(xué)診斷方法
    3 PCR-ELISA技術(shù)研究進(jìn)展
        3.1 引物探針標(biāo)記法
        3.2 雙引物標(biāo)記法
        3.3 PCR-ELISA技術(shù)的應(yīng)用
    4 本研究的目的及意義
材料與方法
    1 材料
        1.1 試驗(yàn)樣本
        1.2 其他病原體
        1.3 引物
        1.4 試驗(yàn)用試劑
        1.5 主要試劑以及配制方法
    2 方法
        2.1 血液DNA模板的提取
        2.2 PCR擴(kuò)增與最佳退火溫度篩選
        2.3 PCR-ELISA檢測方法操作步驟
        2.4 包被液的比較與選擇
        2.5 鏈酶親和素濃度及抗地高辛抗體稀釋濃度的選擇
        2.6 封閉條件篩選
        2.7 顯色時間篩選
        2.8 PCR循環(huán)數(shù)以及稀釋倍數(shù)的篩選
        2.9 PCR-ELISA臨界值的確定
        2.10 PCR-ELISA特異性檢測
        2.11 PCR-ELISA敏感性檢測
        2.12 PCR-ELISA重復(fù)性檢測
        2.13 臨床樣本檢測
結(jié)果
    3.1 目的基因PCR擴(kuò)增及退火溫度篩選
    3.2 包被液的比較與選擇
    3.3 鏈酶親和素濃度及抗地高辛抗體稀釋濃度的選擇
    3.4 封閉條件篩選
    3.5 顯色時間篩選
    3.6 PCR循環(huán)數(shù)以及稀釋倍數(shù)的篩選
    3.7 PCR-ELISA臨界值的確定
    3.8 PCR-ELISA特異性試驗(yàn)
    3.9 PCR-ELISA敏感性檢測
    3.10 PCR-ELISA重復(fù)性檢測
    3.11 臨床樣本檢測
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介
附錄



本文編號：3778291