喹賽多和乙酰甲喹是人工合成的獸藥,屬于喹噁啉類藥物,具有良好的抗菌及促生長作用,被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。研究表明,喹賽多與同類藥物相比毒性小、安全性較好,但其一些代謝產(chǎn)物多對(duì)動(dòng)物存在潛在毒性,會(huì)引起食品安全問題。乙酰甲喹的毒性相對(duì)較大,長期使用或?yàn)E用會(huì)危害動(dòng)物和人類的健康。因此,建立一種快速、靈敏的檢測(cè)方法檢測(cè)動(dòng)物可食性組織中喹賽多和乙酰甲喹的殘留情況有重大意義。本研究分別以脫二氧喹賽多和脫二氧乙酰甲喹為研究對(duì)象,旨在建立一種快速、靈敏、高通量的基于抗體的免疫學(xué)殘留檢測(cè)方法---酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。 脫二氧喹賽多(Cy4)是喹賽多的一種主要代謝產(chǎn)物,已被確定為其殘留標(biāo)志物。本論文根據(jù)脫二氧喹賽多的結(jié)構(gòu)特征,通過羧甲基羥胺的肟化作用引入羧基,再采用混合酸酐法與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián),合成了免疫抗原Cy4-BSA和檢測(cè)抗原Cy4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后獲得了效價(jià)高、靈敏度較高的多克隆抗體,取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤進(jìn)行細(xì)胞融合,經(jīng)三次細(xì)胞克隆和篩選,獲得了3株能穩(wěn)定分泌Cy4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(A3C5、D9D2、F10D2)。制備了單克隆抗體腹水...

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 喹噁啉類藥物的概況
    1.2 喹賽多的研究進(jìn)展
        1.2.1 喹賽多及其理化性質(zhì)
        1.2.2 喹賽多的代謝研究
        1.2.3 喹賽多的安全性研究
        1.2.4 脫二氧喹賽多及其理化性質(zhì)
    1.3 喹賽多及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法研究進(jìn)展
        1.3.1 儀器檢測(cè)方法
            1.3.1.1 高效液相色譜法
            1.3.1.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
            1.3.1.3 液相色譜串聯(lián)離子捕獲時(shí)間飛行質(zhì)譜法
            1.3.1.4 超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法
            1.3.1.5 超高效液相色譜串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜法
        1.3.2 酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
    1.4 乙酰甲喹的研究進(jìn)展
        1.4.1 乙酰甲喹及其理化性質(zhì)
        1.4.2 乙酰甲喹的代謝研究
        1.4.3 乙酰甲喹的安全性研究
        1.4.4 脫二氧乙酰甲喹及其理化性質(zhì)
    1.5 乙酰甲喹及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法研究進(jìn)展
        1.5.1 儀器檢測(cè)方法
            1.5.1.1 高效液相色譜法
            1.5.1.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
            1.5.1.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
            1.5.1.4 超聲波輔助分散液-液微萃取聯(lián)合高效液相色譜紫外檢測(cè)法
        1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法
    1.6 免疫分析在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用
        1.6.1 酶聯(lián)免疫吸附法
        1.6.2 化學(xué)發(fā)光免疫法
        1.6.3 電化學(xué)免疫法
        1.6.4 量子點(diǎn)熒光免疫法
        1.6.5 微陣列法
        1.6.6 免疫層析試紙條法
    1.7 選題目的和意義
第二章 脫二氧喹賽多單克隆抗體制備
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 主要試劑材料
        2.2.2 主要儀器設(shè)備
        2.2.3 主要溶液配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 脫二氧喹賽多完全抗原的制備
            2.3.1.1 脫二氧喹賽多的肟化
            2.3.1.2 免疫抗原的制備
            2.3.1.3 檢測(cè)抗原的制備
        2.3.2 脫二氧喹賽多完全抗原的鑒定
            2.3.2.1 質(zhì)譜法鑒定免疫抗原
            2.3.2.2 紫外掃描法鑒定檢測(cè)抗原
        2.3.3 小鼠免疫和多克隆抗體的制備
        2.3.4 脫二氧喹賽多多克隆抗體的檢測(cè)
            2.3.4.1 方陣法確定最佳檢測(cè)抗原濃度
            2.3.4.2 間接ELISA測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)
            2.3.4.3 多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)
            2.3.4.4 多克隆抗體特異性分析
        2.3.5 脫二氧喹賽多單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
            2.3.5.1 Sp2/0瘤細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)
            2.3.5.2 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
            2.3.5.3 骨髓瘤細(xì)胞的制備
            2.3.5.4 免疫脾細(xì)胞的制備
            2.3.5.5 細(xì)胞融合及培養(yǎng)
            2.3.5.6 陽性孔的篩選
            2.3.5.7 陽性孔的克隆
            2.3.5.8 雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇
        2.3.6 脫二氧喹賽多單克隆抗體腹水的制備
        2.3.7 脫二氧喹賽多單克隆抗體的純化
        2.3.8 脫二氧喹賽多單克隆抗體特性的鑒定
            2.3.8.1 單克隆抗體蛋白濃度的測(cè)定
            2.3.8.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清和單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
            2.3.8.3 單克隆抗體的亞型鑒定
            2.3.8.4 單克隆抗體親和力常數(shù)的測(cè)定
            2.3.8.5 單克隆抗體的ic-ELISA檢測(cè)
            2.3.8.6 單克隆抗體特異性鑒定
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 免疫抗原MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果
        2.4.2 檢測(cè)抗原紫外掃描鑒定結(jié)果
        2.4.3 脫二氧喹賽多多克隆抗體的檢測(cè)結(jié)果
            2.4.3.1 最佳檢測(cè)抗原濃度的確定
            2.4.3.2 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
            2.4.3.3 多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果
            2.4.3.4 多克隆抗體特異性結(jié)果
        2.4.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立
        2.4.5 脫二氧喹賽多單克隆抗體的特性鑒定
            2.4.5.1 單克隆抗體的濃度測(cè)定結(jié)果
            2.4.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清和單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果
            2.4.5.3 單克隆抗體的亞型鑒定結(jié)果
            2.4.5.4 單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定結(jié)果
            2.4.5.5 單克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果
            2.4.5.6 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果
    2.5 討論
第三章 脫二氧喹賽多單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的建立
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 主要試劑材料
        3.2.2 主要儀器設(shè)備
        3.2.3 主要溶液配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件優(yōu)化
            3.3.1.1 檢測(cè)抗原濃度優(yōu)化
            3.3.1.2 封阻液濃度的優(yōu)化
            3.3.1.3 二甲亞砜濃度優(yōu)化
            3.3.1.4 單克隆抗體稀釋度優(yōu)化
            3.3.1.5 標(biāo)品與單克隆抗體比例優(yōu)化
            3.3.1.6 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化
            3.3.1.7 二抗稀釋度優(yōu)化
        3.3.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.3.3 樣品加標(biāo)處理
        3.3.4 加標(biāo)回收率檢測(cè)
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA工作條件的優(yōu)化
            3.4.1.1 檢測(cè)抗原濃度優(yōu)化結(jié)果
            3.4.1.2 封阻液濃度優(yōu)化結(jié)果
            3.4.1.3 二甲亞砜濃度優(yōu)化結(jié)果
            3.4.1.4 單克隆抗體稀釋度優(yōu)化結(jié)果
            3.4.1.5 標(biāo)品與單克隆抗體比例優(yōu)化結(jié)果
            3.4.1.6 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果
            3.4.1.7 二抗稀釋度優(yōu)化結(jié)果
        3.4.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.4.3 加標(biāo)回收檢測(cè)結(jié)果
    3.5 討論
第四章 脫二氧乙酰甲喹多克隆抗體的制備
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 主要試劑材料
        4.2.2 主要儀器設(shè)備
        4.2.3 主要溶液配制
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 脫二氧乙酰甲喹完全抗原的制備
            4.3.1.1 脫二氧乙酰甲喹的肟化
            4.3.1.2 脫二氧乙酰甲喹與BSA、OVA的偶聯(lián)
        4.3.2 脫二氧乙酰甲喹完全抗原的鑒定
            4.3.2.1 質(zhì)譜法鑒定免疫抗原
            4.3.2.2 紫外掃描法鑒定檢測(cè)抗原
        4.3.3 小鼠免疫和多克隆抗體的制備
        4.3.4 脫二氧乙酰甲喹多克隆抗體的檢測(cè)
            4.3.4.1 方陣法確定最佳檢測(cè)抗原濃度
            4.3.4.2 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)
            4.3.4.3 多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)
            4.3.4.4 多克隆抗體特異性分析
        4.3.5 脫二氧乙酰甲喹多克隆抗體加標(biāo)回收檢測(cè)
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 免疫抗原MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果
        4.4.2 檢測(cè)抗原紫外掃描鑒定結(jié)果
        4.4.3 脫二氧乙酰甲喹多克隆抗體的檢測(cè)結(jié)果
            4.4.3.1 最佳檢測(cè)抗原濃度的確定
            4.4.3.2 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
            4.4.3.3 多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果
            4.4.3.4 多克隆抗體特異性結(jié)果
        4.4.4 脫二氧乙酰甲喹多克隆抗體加標(biāo)回收檢測(cè)結(jié)果
    4.5 討論
第五章 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
碩士研究生期間論文發(fā)表情況
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3777927