在哺乳動物中,表觀遺傳修飾對細胞增殖和胚胎的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用,其中組蛋白的甲基化及乙�；筛淖�?nèi)旧w的構象,調(diào)控基因的表達與沉默,進而調(diào)節(jié)個體的發(fā)育。缺失的、小的、同源異形蛋白1(Absent small or homeotic 1,ASH1L)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,可通過甲基化H3K36、拮抗多梳蛋白的表達進而促進個體的生長與發(fā)育。本文研究ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛卵丘細胞及胚胎中的表達和功能,為進一步揭示其對胚胎的調(diào)控機制提供技術和理論基礎。試驗一:為探究ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛卵丘細胞中的表達與功能,對細胞中ASH1L表達進行檢測。結果顯示,ASH1L位于牛卵丘細胞的細胞核中,呈點狀分布。成功篩選到能有效干擾牛Ash1L基因的siRNA-2,其干擾效率為60⁷0%。將siRNA-2轉(zhuǎn)染卵丘細胞后,該干擾組細胞中H3K36me1/2/3三種甲基化水平均顯著低于對照組(P<0.05);干擾Ash1L導致凋亡細胞數(shù)增多、凋亡相關基因Bax、Bcl-2及caspase-3表達水平顯著上調(diào),凋亡基因Bax和caspase-3表達量高于抗凋亡相關基因Bcl-...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 表觀遺傳修飾
        1.1.1 DNA甲基化
        1.1.2 組蛋白修飾
    1.2 PRC2蛋白
    1.3 三胸腔結構蛋白質(zhì)組(TrxG)
    1.4 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L
        1.4.1 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶的晶體結構
        1.4.2 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶功能
    1.5 研究目的與意義
第二章 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛卵丘細胞中的表達與功能研究
    2.1 試驗材料
        2.1.1 材料
        2.1.2 設備及耗材
        2.1.3 主要溶液及其配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 牛卵丘細胞培養(yǎng)
        2.2.2 siRNA的設計與合成
        2.2.3 牛卵丘細胞的轉(zhuǎn)染
        2.2.4 實時熒光定量PCR
        2.2.5 牛卵丘細胞的免疫熒光染色
        2.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡
        2.2.7 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結果與分析
        2.3.1 牛卵丘細胞的培養(yǎng)
        2.3.2 Ash1L基因及其蛋白在牛卵丘細胞中的表達
        2.3.3 牛卵丘細胞的H3K36甲基化修飾狀態(tài)
        2.3.4 牛Ash1L基因有效si RNA序列的篩選及干擾效率檢測
        2.3.5 干擾Ash1L基因?qū)εＢ亚鸺毎蠬3K36 甲基化狀態(tài)的影響
        2.3.6 干擾Ash1L基因?qū)毎蛲龅挠绊?br>        2.3.7 干擾Ash1L基因?qū)Φ蛲鱿嚓P基因表達的影響
        2.3.8 干擾Ash1L基因?qū)RC2 蛋白基因表達的影響
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛體外受精胚胎中的表達及功能研究
    3.1 試驗材料
        3.1.1 材料
        3.1.2 設備及耗材
        3.1.3 主要溶液及其配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 牛早期胚胎的制備
        3.2.2 牛早期胚胎siRNA注射
        3.2.3 引物設計與熒光定量PCR
        3.2.4 免疫熒光染色
        3.2.5 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結果與分析
        3.3.1 Ash1L基因及其蛋白在牛卵母細胞及早期胚胎中的表達
        3.3.2 牛卵母細胞及早期胚胎中H3K36甲基化修飾狀態(tài)
        3.3.3 牛胚胎中Ash1L siRNA干擾效果的驗證
        3.3.4 干擾Ash1L基因?qū)εＴ缙谂咛グl(fā)育的影響
        3.3.5 干擾Ash1L基因?qū)δ遗哔|(zhì)量的影響
        3.3.6 干擾Ash1L基因?qū)εＴ缙谂咛ザ嗄苄曰虮磉_水平的影響
        3.3.7 干擾Ash1L基因?qū)RC2 蛋白亞基基因的影響
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 牛ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶靶基因的預測
    4.1 試驗材料
        4.1.1 材料
        4.1.2 設備及耗材
    4.2 試驗方法
        4.2.1 RNA提取
        4.2.2 建庫測序
        4.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量預處理及分析
        4.2.4 引物設計與熒光定量PCR
    4.3 結果與分析
        4.3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計與檢測
        4.3.2 參考基因組比對
        4.3.3 干擾組與對照組相關性檢驗
        4.3.4 兩組之間差異基因可視化分析
        4.3.5 差異基因的GO注釋及KEGG分析
        4.3.6 干擾組與對照組間差異基因表達
        4.3.7 差異表達基因RT-qPCR驗證
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3777712