在哺乳動(dòng)物中,表觀遺傳修飾對(duì)細(xì)胞增殖和胚胎的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用,其中組蛋白的甲基化及乙�；筛淖�?nèi)旧w的構(gòu)象,調(diào)控基因的表達(dá)與沉默,進(jìn)而調(diào)節(jié)個(gè)體的發(fā)育。缺失的、小的、同源異形蛋白1(Absent small or homeotic 1,ASH1L)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,可通過甲基化H3K36、拮抗多梳蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)個(gè)體的生長(zhǎng)與發(fā)育。本文研究ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛卵丘細(xì)胞及胚胎中的表達(dá)和功能,為進(jìn)一步揭示其對(duì)胚胎的調(diào)控機(jī)制提供技術(shù)和理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)一:為探究ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛卵丘細(xì)胞中的表達(dá)與功能,對(duì)細(xì)胞中ASH1L表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,ASH1L位于牛卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核中,呈點(diǎn)狀分布。成功篩選到能有效干擾牛Ash1L基因的siRNA-2,其干擾效率為60⁷0%。將siRNA-2轉(zhuǎn)染卵丘細(xì)胞后,該干擾組細(xì)胞中H3K36me1/2/3三種甲基化水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05);干擾Ash1L導(dǎo)致凋亡細(xì)胞數(shù)增多、凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2及caspase-3表達(dá)水平顯著上調(diào),凋亡基因Bax和caspase-3表達(dá)量高于抗凋亡相關(guān)基因Bcl-...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 表觀遺傳修飾
        1.1.1 DNA甲基化
        1.1.2 組蛋白修飾
    1.2 PRC2蛋白
    1.3 三胸腔結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組(TrxG)
    1.4 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ASH1L
        1.4.1 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)
        1.4.2 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶功能
    1.5 研究目的與意義
第二章 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛卵丘細(xì)胞中的表達(dá)與功能研究
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 材料
        2.1.2 設(shè)備及耗材
        2.1.3 主要溶液及其配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 牛卵丘細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 siRNA的設(shè)計(jì)與合成
        2.2.3 牛卵丘細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.2.5 牛卵丘細(xì)胞的免疫熒光染色
        2.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡
        2.2.7 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 牛卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3.2 Ash1L基因及其蛋白在牛卵丘細(xì)胞中的表達(dá)
        2.3.3 牛卵丘細(xì)胞的H3K36甲基化修飾狀態(tài)
        2.3.4 牛Ash1L基因有效si RNA序列的篩選及干擾效率檢測(cè)
        2.3.5 干擾Ash1L基因?qū)εＢ亚鸺?xì)胞中H3K36 甲基化狀態(tài)的影響
        2.3.6 干擾Ash1L基因?qū)?xì)胞凋亡的影響
        2.3.7 干擾Ash1L基因?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)基因表達(dá)的影響
        2.3.8 干擾Ash1L基因?qū)RC2 蛋白基因表達(dá)的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在牛體外受精胚胎中的表達(dá)及功能研究
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 材料
        3.1.2 設(shè)備及耗材
        3.1.3 主要溶液及其配制
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 牛早期胚胎的制備
        3.2.2 牛早期胚胎siRNA注射
        3.2.3 引物設(shè)計(jì)與熒光定量PCR
        3.2.4 免疫熒光染色
        3.2.5 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 Ash1L基因及其蛋白在牛卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達(dá)
        3.3.2 牛卵母細(xì)胞及早期胚胎中H3K36甲基化修飾狀態(tài)
        3.3.3 牛胚胎中Ash1L siRNA干擾效果的驗(yàn)證
        3.3.4 干擾Ash1L基因?qū)εＴ缙谂咛グl(fā)育的影響
        3.3.5 干擾Ash1L基因?qū)δ遗哔|(zhì)量的影響
        3.3.6 干擾Ash1L基因?qū)εＴ缙谂咛ザ嗄苄曰虮磉_(dá)水平的影響
        3.3.7 干擾Ash1L基因?qū)RC2 蛋白亞基基因的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 牛ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶靶基因的預(yù)測(cè)
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 材料
        4.1.2 設(shè)備及耗材
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 RNA提取
        4.2.2 建庫測(cè)序
        4.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量預(yù)處理及分析
        4.2.4 引物設(shè)計(jì)與熒光定量PCR
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)與檢測(cè)
        4.3.2 參考基因組比對(duì)
        4.3.3 干擾組與對(duì)照組相關(guān)性檢驗(yàn)
        4.3.4 兩組之間差異基因可視化分析
        4.3.5 差異基因的GO注釋及KEGG分析
        4.3.6 干擾組與對(duì)照組間差異基因表達(dá)
        4.3.7 差異表達(dá)基因RT-qPCR驗(yàn)證
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3777712