A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起人和多種動物的高度接觸性急性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)劃分為通報疫病。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1蛋白(nonstructural protein 1,NS1)通過與細(xì)胞內(nèi)的多種宿主蛋白發(fā)生相互作用來調(diào)節(jié)流感病毒的感染過程,是調(diào)節(jié)AIV致病性的關(guān)鍵因子。為鑒定與H5N6亞型禽流感病毒NS1蛋白有相互作用的宿主蛋白,本研究:1.Strep標(biāo)簽H5N6重組AIV的構(gòu)建。用RT-PCR擴(kuò)增HN109病毒的8個基因片段,分別連接到pBD雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體。通過點突變技術(shù)將NS1基因的77-84位的氨基酸替換成Strep標(biāo)簽。將8個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,拯救出重組病毒株rHN109-NS1-Strep。經(jīng)測序驗證,拯救病毒的8個基因片段與設(shè)計基因一致。測序比對與蛋白表達(dá)驗證Strep標(biāo)簽可以穩(wěn)定遺傳于F5代以內(nèi)的重組病毒;重組毒株與野生毒株在MDCK細(xì)胞上復(fù)制水平相似,在小鼠體內(nèi)復(fù)制能力也相似。2.鴨肺原代上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定。用組織貼塊法從24 d SPF鴨胚中分離肺原代細(xì)胞,經(jīng)差速消化法純化傳代,純化三代后,靶標(biāo)上皮...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
縮略語表
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    1 流感病毒
    2 禽流感病毒及其結(jié)構(gòu)
        2.1 血凝素HA蛋白
        2.2 神經(jīng)氨酸酶NA蛋白
        2.3 病毒聚合酶蛋白PB2、PB1、PA
        2.4 核衣殼蛋白NP
        2.5 基質(zhì)蛋白M
        2.6 非結(jié)構(gòu)蛋白NS
    3 流感病毒的抗病毒機(jī)制及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的作用
        3.1 細(xì)胞抗病毒機(jī)制的拮抗作用
        3.2 NS1拮抗RNA干擾（RNAi）途徑
        3.3 NS1參與細(xì)胞凋亡
        3.4 NS1蛋白調(diào)控樹突狀細(xì)胞的成熟
    4 流感病毒的復(fù)制
        4.1 受體結(jié)合并細(xì)胞進(jìn)入
        4.2 膜融合和脫殼
        4.3 RNA復(fù)制和翻譯
        4.4 病毒裝配和釋放
    5. 研究目的與意義
第二篇 試驗部分
    第一章 表達(dá)Strep標(biāo)簽的重組H5N6亞型禽流感病毒的構(gòu)建
        1 材料與方法
            1.1 細(xì)胞、毒株和實驗動物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
            1.4 RNA的提取與病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄
            1.5 引物設(shè)計與合成
            1.6 病毒各基因片段的PCR擴(kuò)增與回收
            1.7 連接、轉(zhuǎn)化和陽性菌的篩選
            1.8 攜帶Strep標(biāo)簽的NS1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            1.9 八個重組陽性質(zhì)粒中提
            1.10 293T細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)
            1.11 病毒拯救與純化
            1.12 獲救病毒的序列鑒定
            1.13 拯救病毒F5代以內(nèi)Strep標(biāo)簽遺傳穩(wěn)定性鑒定
            1.14 病毒感染MDCK細(xì)胞的生長曲線
            1.15 病毒感染小鼠致病性試驗
            1.16 病毒滴定
        2 結(jié)果
            2.1 HN109各基因片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2 病毒拯救與鑒定
            2.3 拯救病毒F5代以內(nèi)Strep標(biāo)簽的遺傳穩(wěn)定性鑒定
            2.4 病毒感染MDCK細(xì)胞的生長曲線
            2.5 病毒感染小鼠致病性試驗
        3 討論
    第二章 鴨肺原代上皮細(xì)胞的分離與鑒定
        1 材料與方法
            1.1 SPF鴨胚與鴨肺臟組織來源
            1.2 試劑
            1.3 主要儀器
            1.4 鴨肺原代上皮細(xì)胞的分離
            1.5 鴨肺原代上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)
            1.6 鴨肺原代上皮細(xì)胞的純化傳代培養(yǎng)
            1.7 免疫熒光鑒定鴨肺原代上皮細(xì)胞
            1.8 鴨肺原代上皮細(xì)胞生長曲線的測定
        2 結(jié)果
            2.1 鴨肺原代上皮細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)
            2.2 鴨肺原代上皮細(xì)胞的純化傳代培養(yǎng)
            2.3 免疫熒光鑒定鴨肺原代上皮細(xì)胞
            2.4 鴨肺原代上皮細(xì)胞生長曲線的測定
        3 討論
    第三章 與NS1-strep互作的鴨宿主蛋白鑒定
        1 材料和方法
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 主要試劑的配制
            1.4 與NS1-Strep互作的宿主蛋白復(fù)合物的純化
            1.5 SDS-PAGE銀染分析與NS1-strep互作的鴨宿主蛋白
            1.6 Western blotting分析與NS1-strep互作的鴨宿主蛋白
            1.7 質(zhì)譜分析與 NS1-strep 互作的鴨宿主蛋白
        2 結(jié)果
            2.1 SDS-PAGE銀染分析與NS1-strep互作的鴨宿主蛋白
            2.2 Western blot分析與NS1-strep互作的鴨宿主蛋白
            2.3 質(zhì)譜鑒定純化后的蛋白質(zhì)復(fù)合物
        3 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
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導(dǎo)師簡介



本文編號：3777238