發(fā)布時間：2023-04-01 06:46

　　干擾素(interferon, IFN)是由生物體細胞受到病毒或其它誘生劑的作用而產生的分泌性糖蛋白，具有廣泛生物學活性，如抗病毒、抗細胞增殖、免疫調節(jié)等多種生物學活，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。干擾素按其與受體結合的原則，分為I型和II型，后來發(fā)現I型干擾素按其與抗體結合的抗原性不同又可分為兩類，故把I型干擾素又分為α、β兩大類，將原來的II型干擾素命名為γ。IFN-α和IFN-β的分子有序列同源性，共用相同的細胞表面受體——I型干擾素受體（IFNAR），IFN-γ是一種同源二聚體糖蛋白，其細胞表面受體為II型干擾素受體(IFNGR)。I型干擾素受體由兩條鏈組成，α鏈（IFNAR-1）和β鏈(IFNAR-2)，IFNAR-1的生物學功能與干擾素結合以及生物信號傳導有關，而IFNAR-2的生物學功能尚未清楚。 IFNAR-1是IFNAR的一個重要亞單位蛋白，在干擾素與干擾素受體結合的過程中發(fā)揮著重要的作用，因此，研究IFNAR-1在雞消化道各器官的分布對分析干擾素在消化道作用及吸收的部位有重要的意義。本實驗從兩方面來檢測IFNAR-1在消化道各器官的分布：一是基因層面，二是蛋白層面。...

【文章頁數】：81 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
    1.1 干擾素概述
        1.1.1 干擾素的來源和分類
        1.1.2 干擾素的性質和生物學特性
    1.2 干擾素的生物功能和作用機制
    1.3 干擾素發(fā)揮作用的信號轉導通路
    1.4 干擾素在臨床獸醫(yī)中的應用
    1.5 干擾素受體的概述
        1.5.1 干擾素受體的分類及作用
        1.5.2 Ⅰ型干擾素受體的結構
        1.5.3 Ⅱ 型干擾素受體的結構
    1.6 干擾素受體的信號傳導
        1.6.1 干擾素受體的信號傳導途徑
        1.6.2 干擾素受體的第二信使
    1.7 實時熒光定量 PCR
        1.7.1 實時熒光定量 PCR 的分類
        1.7.2 實時熒光定量 PCR 的定量方法
        1.7.3 實時熒光定量 PCR 的應用
        1.7.4 熒光定量 PCR 的優(yōu)點
    1.8 綠色熒光蛋白
    1.9 研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒、細胞及干擾素
        2.1.2 實驗試劑及耗材
        2.1.3 質粒及受體菌
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 試驗所用溶液及其配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 標準陽性質粒的制備
            2.2.1.1 設計引物
            2.2.1.2 IFNAR-1 基因 RNA 的提取
            2.2.1.3 IFNAR-1 基因部分片段的 RT-PCR 擴增
            2.2.1.4 IFNAR-1 基因部分片段 PCR 產物的純化回收
            2.2.1.5 目的基因的連接轉化及鑒定
                2.2.1.5.1 目的基因與 pMD18-T 載體的連接體系
                2.2.1.5.2 大腸桿菌感受態(tài)細胞（E.coli DH5α）的制備
                2.2.1.5.3 連接產物轉化
            2.2.1.6 重組質粒 DNA 的提取
            2.2.1.7 重組質粒的鑒定
            2.2.1.8 陽性克隆序列的測序
        2.2.2 內參基因質粒標準品的制備
        2.2.3 SYBR Green I 實時熒光定量 PCR 的建立
            2.2.3.1 質粒標準品原始定量
            2.2.3.2 熒光定量 PCR 反應條件的優(yōu)化
            2.2.3.3 SYBR GreenⅠ實時熒光定量 PCR 的反應體系及程序
            2.2.3.4 標準曲線的建立
        2.2.4 臨床樣品檢測
            2.2.4.1 組織樣本的采集
            2.2.4.2 臨床樣品組織中 RNA 的提取
            2.2.4.3 反轉錄反應
            2.2.4.4 實時熒光定量 PCR 檢測不同器官的 IFNAR-1 的拷貝量
        2.2.5 蛋白吸附實驗
            2.2.5.1 雞 IFN-β基因的克隆
                2.2.5.1.1 引物設計
                2.2.5.1.2 雞 IFN-β基因組織 RNA 的提取
                2.2.5.1.3 IFNβ基因部分片段的 RT-PCR 擴增
                2.2.5.1.4 IFN-β基因部分片段 PCR 產物的純化回收
            2.2.5.2 構建 pMD-IFN-β載體
                2.2.5.2.1 目的基因與 pMD18-T 的連接
                2.2.5.2.2 連接產物轉化
                2.2.5.2.3 重組質粒 DNA 的提取
                2.2.5.2.4 重組質粒的鑒定
                2.2.5.2.5 陽性克隆序列的測序
            2.2.5.3 構建 pEGFP-N1- IFN-β載體
                2.2.5.3.1 酶切 pMD-IFN-β和 pEGFP-N1 空載體
                2.2.5.3.2 連接
                2.2.5.3.3 連接產物轉化
                2.2.5.3.4 陽性克隆的鑒定
                2.2.5.3.5 陽性克隆序列測序
            2.2.5.4 PCR 擴增 IFN-β+GFP 融合基因
            2.2.5.5 構建 pcDNA3.1-N1-IFN-β+GFP 載體
                2.2.5.5.1 PCR 產物的純化回收
                2.2.5.5.2 融合基因 IFN-β+GFP 與 pcDNA3.1-N1 載體的連接
                2.2.5.5.3 連接產物轉化
                2.2.5.5.4 陽性克隆的鑒定
                2.2.5.5.5 陽性克隆序列測序
            2.2.5.6 重組質粒 pcDNA3.1-N1-IFN-β+GFP 的提取
            2.2.5.7 293T 細胞的制備
            2.2.5.8 IFN-β+GFP 融合基因的真核表達
                2.2.5.8.1 真核表達載體的轉染
                2.2.5.8.2 倒置熒光顯微鏡檢測重組 IFN-β+GFP 蛋白的瞬時表達
            2.2.5.9 鎳柱純化融合蛋白
            2.2.5.10 表達的重組 IFN-β+GFP 蛋白的 Western blot 鑒定
            2.2.5.11 合蛋白的除鹽、濃度測定
            2.2.5.12 切片的制備
            2.2.5.13 融合蛋白 IFN-β+GFP 浸潤切片顯色
        2.2.6 口服干擾素及干擾素抗病毒活性的檢測
3 結果與分析
    3.1 反轉錄或得 IFNAR-1 部分基因
    3.2 pMD-IFNAR-1 和 pMD-β-actin 質粒的 PCR 鑒定
    3.3 熒光定量 PCR 反應條件的優(yōu)化
    3.4 熒光定量 PCR 檢測 IFNAR-1、β-actin 基因標準曲線的建立
    3.5 臨床樣品的檢測結果
    3.6 反轉錄或得 IFN-β基因
    3.7 pEGFP-N1- IFN-β質粒的雙酶切鑒定
    3.8 PCR 擴增 IFN-β和 GFP 融合基因
    3.9 pcDNA3.1-N1- IFN-β-GFP 載體的雙酶切鑒定
    3.10 倒置熒光顯微鏡檢測重組 IFN-β+GFP 蛋白的瞬時表達
    3.11 Western -Blot 檢測 IFN-β+GFP 融合蛋白
    3.12 考馬斯亮藍法測定重組蛋白的濃度
        3.12.1 標準曲線的繪制
        3.12.2 蛋白質待測樣品液測定結果
    3.13 融合蛋白 IFN-β-GFP 浸潤切片顯色
    3.14 口服干擾素及干擾素抗病毒活性的檢測
4 討論
5 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3776650