酸性紅73(AR73)是一種化學合成的紅色偶氮染料，主要用于羊毛、絲織物、皮革和染發(fā)產品之中。然而由于其有較強的著色能力，一些食品加工企業(yè)往往將其非法作為蝦、肉等食品著色劑使用。有研究表明AR73具有強致癌性，如果食品中殘留極微量的染料也會對人體健康產生很大危害。因此，世界很多國家已明令禁止將其作為食品著色劑使用。目前，有關ELISA檢測蝦仁中AR73的方法尚未報道。本研究擬首次建立一種ELISA方法用來檢測蝦仁中的AR73。 本文分別采用活性酯法和N，N-羰基二咪唑(CDI)法合成了酸性紅73(AR73)的免疫原和包被原，AR73與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯比分別為12:1和6:1，與卵清蛋白(OA)的偶聯比分別為13:1和3:1，經免疫動物獲得了多克隆抗體。然后分別采用飽和硫酸銨法和辛酸-硫酸銨法純化了兔抗AR73IgG。通過二喹啉甲酸(BCA)法、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試驗、間接ELISA法分別測定IgG的濃度、純度及效價。試驗結果顯示，飽和硫酸銨法所提IgG濃度為36.44mg/mL,最高效價達1.6×105；辛酸-硫酸銨法所提IgG濃度為15...

【文章頁數】：57 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 酸性紅 73 的概述
    2 酸性紅 73 的研究現狀
        2.1 酸性紅 73 的危害
        2.2 殘留特性及檢測方法
        2.3 合成人工抗原的方法
    3 研究內容、目標及意義
        3.1 研究內容
        3.2 研究目標
        3.3 擬解決的關鍵問題
        3.4 研究意義
第二章 酸性紅 73 人工抗原的合成與鑒定
    1 材料
        1.1 試劑與藥品
        1.2 儀器與設備
        1.3 溶液系統
    2 方法
        2.1 人工抗原的合成
            2.1.1 活性酯法
            2.1.2 N，N-羰基二咪唑(CDI)法
        2.2 人工抗原的鑒定
            2.2.1 人工抗原濃度的測定
            2.2.2 紫外分光光度法
            2.2.3 SDS-PAGE 法
    3 結果
        3.1 人工抗原濃度測定結果
        3.2 紫外分光光度法鑒定結果
            3.2.1 免疫原 AR73-HS-BSA 鑒定結果
            3.2.2 包被原 AR73-HS-OA 鑒定結果
            3.2.3 免疫原 AR73-BSA 鑒定結果
            3.2.4 包被原 AR73-OA 鑒定結果
        3.3 SDS-PAGE 法鑒定結果
    4 討論
        4.1 人工抗原的濃度
        4.2 AR73 的半抗原與偶聯物
    5 結論
第三章 AR73 多克隆抗體的制備與純化
    1 材料
        1.1 試劑與藥品
        1.2 儀器和設備
        1.3 實驗動物
        1.4 溶液系統
    2 方法
        2.1 多克隆抗體的制備
        2.2 多克隆抗體純化方法的比較
            2.2.1 飽和硫酸銨法
            2.2.2 辛酸-硫酸銨法
            2.2.3 改良 BCA 法測 IgG 濃度
            2.2.4 SDS-PAGE 測 IgG 純度
            2.2.5 間接 ELISA 方法測 IgG 效價
        2.3 多克隆抗體的篩選
            2.3.1 雙向瓊脂擴散法
            2.3.2 篩選血清 IgG 組分的提取
    3 結果
        3.1 兩種純化方法的比較
            3.1.1 IgG 濃度的比較結果
            3.1.2 IgG 純度的測定
            3.1.3 IgG 效價的比較結果
        3.2 多克隆抗體的篩選結果
            3.2.1 雙向瓊脂擴散實驗結果
            3.2.2 篩選血清的分離純化結果
    4 討論
        4.1 多克隆抗體的純化方法
        4.2 多克隆抗體的篩選
    5 結論
第四章 間接 ELISA 檢測方法的建立及其應用
    1 材料
        1.1 試劑與藥品
        1.2 儀器與設備
        1.3 溶液系統
    2 方法
        2.1 間接 ELISA 方法的建立
            2.1.1 最佳組合與最適工作濃度的選擇
            2.1.2 間接 ELISA 方法標準曲線的建立
        2.2 間接 ELISA 方法反應體系的優(yōu)化
            2.2.1 酶標板均一性的測定
            2.2.2 包被液及包被方式的選擇
            2.2.3 封閉液的篩選
            2.2.4 抗體稀釋液及溫育時間的確定
            2.2.5 酶標二抗稀釋倍數與反應時間的選擇
            2.2.6 底物反應體系及溫育時間的優(yōu)化
            2.2.7 優(yōu)化后 ELISA 方法的重新建立
            2.2.8 ELISA 方法的特異性檢測
        2.3 樣品制備及添加回收率的計算
            2.3.1 樣品的制備
            2.3.2 添加回收率的計算
            2.3.3 實際樣品的檢測
    3 結果
        3.1 間接 ELISA 方法的建立
            3.1.1 最佳組合與最適工作濃度的確定
            3.1.2 標準曲線的建立
        3.2 ELISA 方法的優(yōu)化結果
            3.2.1 酶標板均一性測定結果
            3.2.2 包被液及包被方式的確定
            3.2.3 封閉液的確定
            3.2.4 抗體稀釋液及溫育時間的優(yōu)化
            3.2.5 酶標二抗稀釋倍數與反應時間的選擇
            3.2.6 底物及反應時間的確定
            3.2.7 間接 ELISA 方法的重新建立
            3.2.8 特異性測定結果
        3.3 樣品制備及添加回收率的計算
            3.3.1 AR73 樣品制備
            3.3.2 準確性的測定
            3.3.3 實際樣品檢測結果
    4 討論
        4.1 間接 ELISA 方法的優(yōu)化
        4.2 間接 ELISA 方法的特異性和準確度
    5 結論
全文結論
    1 主要結論
    2 本文章存在的不足
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表或錄用的論文



本文編號：3774815