H5N1亞型高致病性禽流感不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的危害,而且威脅人類健康與公共衛(wèi)生安全。滅活疫苗免疫是目前防控禽流感的有效措施之一,但滅活苗候選株的篩選耗時費力,且疫苗生產過程涉及活病毒,存在生物安全隱患,并受雞胚供應的限制。禽流感血凝素(Hemagglutinin, HA)亞單位疫苗可以避免滅活苗的缺點,HA蛋白是禽流感病毒主要表面抗原,具有刺激機體產生中和抗體的作用,是研發(fā)亞單位疫苗的主要靶標蛋白。其他研究表明桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的HA+M1蛋白,其生物學活性、抗原性和免疫原性方面與天然HA蛋白極為相似,但是目前關于桿狀病毒表達系統(tǒng)表達HA蛋白,其生物學活性、抗原性和免疫原性方面報道相對較少。因此,本研究利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達H5亞型禽流感HA蛋白,并對該重組蛋白的血凝活性、VLP (Virus-like particle, VLP)組裝、免疫原性等進行研究。構建含HA基因的克隆載體。兩種途徑獲得HA基因。用RT-PCR方法從禽流感(H5亞型,Re-6株)檢測抗原中擴增HA基因,命名為L。另根據GenBank中HA基因進行比對分析,選取HA基因序列,命名為H。再根據昆蟲細胞的密碼...

【文章頁數】：64 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要英文縮寫
文獻綜述
引言
1 材料與方法
    1.1 菌株與質粒等
    1.2 主要試劑(盒)
    1.3 溶液與培養(yǎng)基
        1.3.1 抗生素母液
        1.3.2 X-Gal、IPTG、PHA和MTT
        1.3.3 LB培養(yǎng)基
        1.3.4 PBS(PBST)緩沖液
        1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳
        1.3.6 Western blot相關溶液
    1.4 PCR引物設計與合成
    1.5 SDS-PAGE相關試劑
    1.6 主要儀器
    1.7 基因克隆及序列分析
        1.7.1 RNA提取
        1.7.2 反轉錄
        1.7.3 目的基因擴增
        1.7.4 連接與轉化
        1.7.5 重組克隆質粒鑒定
        1.7.6 基因序列優(yōu)化與合成
    1.8 H5N1亞型禽流感HA基因重組
        1.8.1 H-NSTHA基因片段克隆
        1.8.2 H-HA基因片段克隆
        1.8.3 L-NSTHA基因片段克隆
        1.8.4 L-HA基因片段克隆
        1.8.5 連接與轉化
        1.8.6 重組質粒鑒定
    1.9 重組桿狀病毒表達質粒的構建
        1.9.1 雙酶切
        1.9.2 連接與轉化
        1.9.3 重組質粒鑒定
        1.9.4 E.coli DH10Bac感受態(tài)細胞制備
        1.9.5 重組質粒轉化與篩選
        1.9.6 重組真核表達質粒鑒定
    1.10 重組桿狀病毒的制備和鑒定
        1.10.1 重組Bacmid DNA轉染昆蟲細胞
        1.10.2 重組P2/P3代桿狀病毒的擴增
        1.10.3 重組桿狀病毒鑒定
        1.10.4 重組桿狀病毒滴度測定
    1.11 重組桿狀病毒表達蛋白分析
        1.11.1 重組蛋白SDS-PAGE分析
        1.11.2 重組蛋白Western blot分析
        1.11.3 間接免疫熒光(IFA)
        1.11.4 重組蛋白的血凝價
        1.11.5 電鏡觀察VLP形態(tài)
    1.12 重組蛋白的免疫原性
        1.12.1 動物免疫實驗
        1.12.2 CD4+、CD8+ T淋巴細胞動態(tài)變化檢測
        1.12.3 淋巴細胞轉化實驗
2 結果與分析
    2.1 禽流感HA基因的克隆及序列分析
        2.1.1 HA基因PCR擴增結果
        2.1.2 重組克隆質粒的PCR鑒定
        2.1.3 HA基因測序結果與序列分析
    2.2 H5亞型禽流感HA基因的重組
        2.2.1 H-NSTHA基因的重組
        2.2.2 L-NSTHA基因的重組
        2.2.3 全基因的PCR片段的擴增
        2.2.4 重組克隆質粒的酶切鑒定
    2.3 重組真核表達載體的構建
        2.3.1 重組供體質粒構建與鑒定
        2.3.2 重組穿梭載體的構建與鑒定
    2.4 重組桿狀病毒的制備與鑒定
        2.4.1 重組桿狀病毒的制備
        2.4.2 重組桿狀病毒的鑒定
        2.4.3 重組桿狀病毒滴度的測定
    2.5 重組蛋白在昆蟲細胞上的表達
        2.5.1 重組蛋白SDS-PAGE鑒定
        2.5.2 重組蛋白Western blot分析
        2.5.3 間接免疫熒光檢測(IFA)
        2.5.4 重組蛋白的血凝活性的檢測
        2.5.5 電鏡觀察結果
    2.6 重組蛋白的免疫原性
        2.6.1 HI檢測抗體水平
        2.6.2 間接ELISA檢測抗體
        2.6.3 CD4+、CD8+ T淋巴細胞動態(tài)變化
        2.6.4 淋巴細胞增殖試驗
3 討論
    3.1 高致病性禽流感H5N1 HA基因的設計
    3.2 H5N1亞型禽流感重組HA蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)表達
    3.3 重組HA蛋白免疫原性
結論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3769850