目的本試驗以圍產期脂肪肝奶牛和體外奶牛脂肪肝細胞模型為研究對象,運用腺病毒轉染技術過表達SIRT1基因,研究SIRT1對奶牛肝細胞氧化應激狀態(tài)、SIRT1基因和蛋白表達水平及下游脂代謝相關蛋白和關鍵酶表達水平和活性及肝脂沉積的影響,明確SIRT1在奶牛脂肪肝病發(fā)生中的作用機制,為闡明奶牛脂肪肝的發(fā)病機制和尋找治療靶點奠定理論和實驗基礎。方法選取12頭奶牛,頸靜脈采集血液分離出血清,常規(guī)方法處死后無菌采集肝臟組織樣品,經檢測血清和肝臟組織TG含量,篩選出6頭為對照奶牛、6頭為脂肪肝奶牛。采用改良膠原酶兩步灌流法分離培養(yǎng)新生犢牛肝細胞,添加不同濃度OA溶液(0、0.25、0.5、0.75 m M)作用不同時間點確定最佳體外奶牛脂肪肝細胞模型OA添加濃度和時間。體外培養(yǎng)奶牛脂肪肝細胞到最佳生長狀態(tài),一部分添加NEFAs、NAC、NEFAs+NAC處理細胞肝細胞,另一部分轉染適量過表達SIRT1腺病毒,于肝細胞培養(yǎng)結束收集細胞。采用生化分析儀檢測脂代謝指標;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清和肝臟組織中氧化抗氧化指標;采用免疫熒光技術確定最佳重組腺病毒添加量;采用實時熒光定量PCR(q ...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
縮寫和符號清單
文獻綜述
引言
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 試驗動物
        1.1.2 實驗主要材料
        1.1.3 主要儀器
    1.2 試驗方法
        1.2.1 溶液配制
        1.2.2 腺病毒構建
        1.2.3 體內試驗樣品采集
        1.2.4 原代肝細胞的分離培養(yǎng)
        1.2.5 最佳添加濃度和時間
        1.2.6 試驗分組及處理
        1.2.7 組織學的檢測
        1.2.8 血液、肝臟組織中生化指標檢測
        1.2.9 ELISA法檢測氧化抗氧化指標及SIRT1酶活性
        1.2.10 熒光定量PCR(qRT-PCR)法測定SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α信號通路關鍵因子mRNA的相對表達量
        1.2.11 Westernblot法測定SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α信號通路相關蛋白的表達
        1.2.12 免疫熒光(IF)檢測腺病毒轉染過表達SIRT1基因的蛋白表達
        1.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
2 結果與分析
    2.1 脂肪肝奶牛血液、肝臟中脂代謝功能紊亂
        2.1.1 圍產期對照奶牛和脂肪肝奶牛肝臟組織學檢測
        2.1.2 圍產期對照奶牛和脂肪肝奶牛血液生化指標變化
        2.1.3 圍產期對照奶牛和脂肪肝奶牛血清、肝臟氧化抗氧化指標變化
        2.1.4 圍產期對照奶牛和脂肪肝奶牛肝臟脂代謝指標變化
        2.1.5 圍產期對照奶牛和脂肪肝奶牛肝臟組織中SIRT1通路的變化
    2.2 過表達SIRT1腺病毒對肝細胞脂代謝的影響
        2.2.1 體外肝細胞形態(tài)學觀察
        2.2.2 添加OA高脂造模最佳濃度的篩選
        2.2.3 過表達SIRT1腺病毒載體的成功構建的鑒定
        2.2.4 腺病毒轉染肝細胞最佳濃度的篩選
        2.2.5 OA造模脂沉積對肝細胞SIRT1、脂代謝和氧化應激關鍵分子表達的影響
        2.2.6 添加NEFAs對造模高脂肝細胞脂代謝和SIRT1通路的影響
        2.2.7 轉染過表達SIRT1腺病毒在氧化應激介導的奶牛肝細胞中脂質沉積的作用機制
3 討論
    3.1 肝脂沉積對SIRT1、脂代謝和氧化應激關鍵分子表達和酶活的影響
    3.2 氧化應激對SIRT1和脂代謝關鍵分子表達和酶活及肝脂沉積的影響
    3.3 過表達奶牛肝細胞SIRT1對脂代謝和氧化應激關鍵分子表達和酶活的影響
4 結論
參考文獻
作者簡介



本文編號：3762454