目的本試驗(yàn)以圍產(chǎn)期脂肪肝奶牛和體外奶牛脂肪肝細(xì)胞模型為研究對象,運(yùn)用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)SIRT1基因,研究SIRT1對奶牛肝細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)、SIRT1基因和蛋白表達(dá)水平及下游脂代謝相關(guān)蛋白和關(guān)鍵酶表達(dá)水平和活性及肝脂沉積的影響,明確SIRT1在奶牛脂肪肝病發(fā)生中的作用機(jī)制,為闡明奶牛脂肪肝的發(fā)病機(jī)制和尋找治療靶點(diǎn)奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法選取12頭奶牛,頸靜脈采集血液分離出血清,常規(guī)方法處死后無菌采集肝臟組織樣品,經(jīng)檢測血清和肝臟組織TG含量,篩選出6頭為對照奶牛、6頭為脂肪肝奶牛。采用改良膠原酶兩步灌流法分離培養(yǎng)新生犢牛肝細(xì)胞,添加不同濃度OA溶液(0、0.25、0.5、0.75 m M)作用不同時(shí)間點(diǎn)確定最佳體外奶牛脂肪肝細(xì)胞模型OA添加濃度和時(shí)間。體外培養(yǎng)奶牛脂肪肝細(xì)胞到最佳生長狀態(tài),一部分添加NEFAs、NAC、NEFAs+NAC處理細(xì)胞肝細(xì)胞,另一部分轉(zhuǎn)染適量過表達(dá)SIRT1腺病毒,于肝細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束收集細(xì)胞。采用生化分析儀檢測脂代謝指標(biāo);采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清和肝臟組織中氧化抗氧化指標(biāo);采用免疫熒光技術(shù)確定最佳重組腺病毒添加量;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q ...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
縮寫和符號(hào)清單
文獻(xiàn)綜述
引言
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要材料
        1.1.3 主要儀器
    1.2 試驗(yàn)方法
        1.2.1 溶液配制
        1.2.2 腺病毒構(gòu)建
        1.2.3 體內(nèi)試驗(yàn)樣品采集
        1.2.4 原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)
        1.2.5 最佳添加濃度和時(shí)間
        1.2.6 試驗(yàn)分組及處理
        1.2.7 組織學(xué)的檢測
        1.2.8 血液、肝臟組織中生化指標(biāo)檢測
        1.2.9 ELISA法檢測氧化抗氧化指標(biāo)及SIRT1酶活性
        1.2.10 熒光定量PCR(qRT-PCR)法測定SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA的相對表達(dá)量
        1.2.11 Westernblot法測定SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)
        1.2.12 免疫熒光(IF)檢測腺病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)SIRT1基因的蛋白表達(dá)
        1.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 脂肪肝奶牛血液、肝臟中脂代謝功能紊亂
        2.1.1 圍產(chǎn)期對照奶牛和脂肪肝奶牛肝臟組織學(xué)檢測
        2.1.2 圍產(chǎn)期對照奶牛和脂肪肝奶牛血液生化指標(biāo)變化
        2.1.3 圍產(chǎn)期對照奶牛和脂肪肝奶牛血清、肝臟氧化抗氧化指標(biāo)變化
        2.1.4 圍產(chǎn)期對照奶牛和脂肪肝奶牛肝臟脂代謝指標(biāo)變化
        2.1.5 圍產(chǎn)期對照奶牛和脂肪肝奶牛肝臟組織中SIRT1通路的變化
    2.2 過表達(dá)SIRT1腺病毒對肝細(xì)胞脂代謝的影響
        2.2.1 體外肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
        2.2.2 添加OA高脂造模最佳濃度的篩選
        2.2.3 過表達(dá)SIRT1腺病毒載體的成功構(gòu)建的鑒定
        2.2.4 腺病毒轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞最佳濃度的篩選
        2.2.5 OA造模脂沉積對肝細(xì)胞SIRT1、脂代謝和氧化應(yīng)激關(guān)鍵分子表達(dá)的影響
        2.2.6 添加NEFAs對造模高脂肝細(xì)胞脂代謝和SIRT1通路的影響
        2.2.7 轉(zhuǎn)染過表達(dá)SIRT1腺病毒在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的奶牛肝細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的作用機(jī)制
3 討論
    3.1 肝脂沉積對SIRT1、脂代謝和氧化應(yīng)激關(guān)鍵分子表達(dá)和酶活的影響
    3.2 氧化應(yīng)激對SIRT1和脂代謝關(guān)鍵分子表達(dá)和酶活及肝脂沉積的影響
    3.3 過表達(dá)奶牛肝細(xì)胞SIRT1對脂代謝和氧化應(yīng)激關(guān)鍵分子表達(dá)和酶活的影響
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
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本文編號(hào)：3762454