發(fā)布時間：2023-03-05 19:57

　　豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是冠狀病毒成員,可導致各種年齡的豬發(fā)生嘔吐、水樣腹瀉以致脫水死亡,新生仔豬的發(fā)病率和死亡率可達100%。該病在全球范圍內(nèi)分布很廣,給世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來非常嚴重的經(jīng)濟損失。 從2010年,我國許多省份的豬場相繼發(fā)生了嚴重的腹瀉(疑似病毒性腹瀉),發(fā)病率和死亡率都極高,黑龍江省各地免疫過的豬場也難以幸免。鑒于此,本實驗室于2012年3月～2012年12月收集白黑龍江省和l內(nèi)蒙占自治區(qū)豬場共10份發(fā)生嚴重腹瀉的仔豬小腸及糞便樣品,通過RT-PCR法確定了病原,其中9份為PEDV單獨感染,1份與豬輪狀病毒混合感染,無TGEV感染情況。結(jié)果表明黑龍江省腹瀉病原中,PEDV主導。 本研究通過RT-PCR法克隆了10株P(guān)EDV S1區(qū)基因以及其中HLJ-2012株的結(jié)構(gòu)基因及ORF3基因,分別克隆到pMD18-T載體上,篩選出陽性重組子進行序列的測定,并與參考毒株進行序列比較、分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析本實驗中的流行毒株與參考毒株的遺傳變異情況和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。10株P(guān)EDV SI區(qū)基因均由2376個核苷酸組成...

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 豬流行性腹瀉的概述
    1.2 PEDV的生物學特征
        1.2.1 PEDV的分類地位及生物學特征
        1.2.2 PEDV基因組及其各段編碼蛋白功能
        1.2.3 開放閱讀框3(ORF3)及其編碼的SNE蛋白
    1.3 豬流行性腹瀉病毒體內(nèi)外感染的特性
        1.3.1 體內(nèi)致病性
        1.3.2 體外培養(yǎng)特征
    1.4 PED免疫學研究概況
        1.4.1 PEDV感染仔豬后的免疫反應(yīng)
        1.4.2 PEDV感染后的抗體產(chǎn)生及其保護作用
        1.4.3 PED的疫苗研究
    1.5 PED診斷方法的研究進展
        1.5.1 免疫電鏡法
        1.5.2 免疫熒光法
        1.5.3 微量血清中和試驗
        1.5.4 ELISA法
        1.5.5 RT-PCR法
    1.6 本研究的目的與意義
2 材料及方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 豬小腸和糞便病料
        2.1.2 細胞與病毒
        2.1.3 菌種
        2.1.4 實驗動物
        2.1.5 引物
        2.1.6 細胞培養(yǎng)液及分子生物學試劑
        2.1.7 主要儀器設(shè)備
        2.1.8 試驗用緩沖液及培養(yǎng)基
    2.2 實驗方法
        2.2.1 PEDV序列的測定
        2.2.2 PEDV HLJ-2012株兔源抗體對LJB/03株的中和試驗
        2.2.3 PEDV HLJ-2012株的分離培養(yǎng)
3 結(jié)果與分析
    3.1 PEDV流行毒株S基因S1區(qū)的擴增
    3.2 病毒S基因S1區(qū)的克隆和序列分析
    3.3 基于S基因S1區(qū)的遺傳演化關(guān)系
    3.4 HLJ-2012株結(jié)構(gòu)基因、ORF3基因分子鑒定及遺傳變異分析
        3.4.1 PEDV HLJ-2012株S、E、M、N及ORF3基因的擴增
        3.4.2 S、E、M、N及ORF3基因的克隆及序列測定
        3.4.3 S基因序列分析及S蛋白抗原區(qū)域、抗原表位分析
        3.4.4 N基因序列分析
        3.4.5 M和E基因的序列分析
        3.4.6 ORF3的序列分析
        3.4.7 基于S基因的遺傳演化關(guān)系
        3.4.8 基于N、M、E基因的遺傳演化關(guān)系
    3.5 LJB/03株TCID50的測定結(jié)果
    3.6 N蛋白表達并純化
    3.7 間接ELISA檢測家兔體內(nèi)抗體水平
    3.8 中和試驗檢測抗體水平
    3.9 病毒HLJ-2012株在vero細胞上的培養(yǎng)
    3.10 間接免疫熒光檢測結(jié)果
    3.11 直接負染電鏡法觀察病毒結(jié)果
    3.12 間接ELISA檢測結(jié)果
    3.13 RT-PCR檢測的結(jié)果
    3.14 原始毒與傳代毒M基因部分片段的分析結(jié)果
    3.15 HLJ-2012分離毒TCID50的測定結(jié)果
4 討論
    4.1 病料檢測結(jié)果及病毒遺傳變異情況
    4.2 基于S基因的序列分析及進化樹分析
    4.3 關(guān)于N基因的序列分析
    4.4 關(guān)于M基因的序列分析
    4.5 關(guān)于E基因的序列分析
    4.6 關(guān)于ORF3的序列分析
    4.7 關(guān)于HLJ-2012株兔源抗體對LJB/03株的中和試驗的分析
    4.8 PEDV HLJ-2012株在vero細胞上的分離培養(yǎng)
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
附錄
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文



本文編號：3756820