犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬,能感染犬引發(fā)犬流感,出現(xiàn)輕度咳嗽、流涕等輕度癥狀,以及高燒、呼吸急促、膿性鼻涕、厭食、抑郁和出血性肺炎等重度癥狀。目前,流行病學(xué)研究證實馬源H3N8和禽源H3N2亞型犬流感病毒能夠在犬類中穩(wěn)定傳播,流感病毒成功的實現(xiàn)由馬到犬、由禽到犬的跨種間傳播,犬逐漸成為流感病毒進(jìn)化和繁衍的“溫床”。犬作為人類的伴侶動物,在現(xiàn)代人類生活中具有特殊的地位,犬作為流感病毒的中間宿主存在著將病毒傳染給人類的潛在風(fēng)險,將給人類健康帶來巨大的威脅。由于流感病毒易發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)移,針對病毒表面抗原的中和抗體及疫苗需要不斷更新,疫苗的時效性存在很大的問題,因此通用型犬流感病毒抗體藥物的研究迫在眉睫。本研究以流感病毒高度保守的M1蛋白為靶標(biāo),通過噬菌體抗體庫篩選特異性抗M1蛋白的scFv,并對scFv進(jìn)行免疫結(jié)合活性和生物學(xué)活性研究;然后將利用具有高效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的TAT蛋白構(gòu)建TAT-scFv穿梭胞內(nèi)抗體,在細(xì)胞水平和SPF雞胚中評價胞內(nèi)抗體對A/Canine/Guangdong/05/2011(H3N2)、A/...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 犬流感病毒的研究進(jìn)展
        1.1 病原學(xué)特征
        1.2 流行病學(xué)
            1.2.1 H3N8 亞型犬流感病毒
            1.2.2 H3N2 亞型犬流感病毒
            1.2.3 H3N8和H3N2 亞型犬流感病毒地理分布
        1.3 發(fā)病
            1.3.1 感染途徑
            1.3.2 病毒復(fù)制
            1.3.3 孵化和脫落期
        1.4 臨床癥狀
        1.5 診斷
            1.5.1 臨床診斷
            1.5.2 血清學(xué)診斷
            1.5.3 分子生物學(xué)診斷
        1.6 預(yù)防
            1.6.1 病毒滅活疫苗
            1.6.2 減毒活疫苗
            1.6.3 病毒樣顆粒疫苗
        1.7 治療
        1.8 公共衛(wèi)生
        1.9 展望
第二篇 研究內(nèi)容
    第一章 H3N2 犬流感病毒M1 蛋白的原核表達(dá)及鑒定
        1.1 材料
            1.1.1 病毒、質(zhì)粒和菌種
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 實驗動物
            1.1.4 主要儀器
            1.1.5 溶液配制
        1.2 方法
            1.2.1 引物設(shè)計與合成
            1.2.2 M1 基因的擴(kuò)增及目的片段回收
            1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            1.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
            1.2.5 重組質(zhì)粒p ET-SUMO-M1 的鑒定及轉(zhuǎn)化
            1.2.6 目的蛋白M1 的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)鑒定
            1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物的初步純化
            1.2.8 純化產(chǎn)物的Western blot鑒定
            1.2.9 目的蛋白的精純
            1.2.10 M1 蛋白多抗的制備及效價測定
            1.2.11 目的蛋白的Western blot鑒定
        1.3 結(jié)果
            1.3.1 M1 基因的擴(kuò)增
            1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-SUMO-M1 的構(gòu)建及PCR鑒定
            1.3.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析
            1.3.4 重組融合蛋白的純化和Western blot分析
            1.3.5 目的蛋白的純化
            1.3.6 M1 蛋白多抗的制備
            1.3.7 純化的目的蛋白的Western blot分析
        1.4 討論
        1.5 小結(jié)
    第二章 抗犬流感病毒H3N2-M1 scFv的篩選及活性研究
        2.1 材料
            2.1.1 主要材料
            2.1.2 溶液配制
        2.2 方法
            2.2.1 噬菌體抗體庫Tomlison I+J次級抗體庫制備
            2.2.2 抗H3N2-M1 單鏈抗體的篩選
            2.2.3 抗H3N2-M1 單鏈抗體的表達(dá)
            2.2.4 抗H3N2-M1 陽性菌株ELISA檢測
            2.2.5 抗H3N2-M1 陽性菌株P(guān)CR鑒定及測序
            2.2.6 抗H3N2-M1-sc Fv的純化
            2.2.7 scFv的 WB鑒定和免疫結(jié)合活性分析
            2.2.8 細(xì)胞水平sc Fv的活性研究
            2.2.9 SPF雞胚中sc Fv的活性研究
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 次級噬菌體抗體庫的擴(kuò)增結(jié)果
            2.3.2 文庫篩選結(jié)果
            2.3.3 陽性菌株篩選和PCR鑒定結(jié)果
            2.3.4 抗H3N2-M1 陽性菌株序列分析
            2.3.5 抗H3N2-M1 單鏈抗體的純化
            2.3.6 scFv的 WB鑒定和免疫結(jié)合活性分析
            2.3.7 細(xì)胞水平sc Fv的活性研究
            2.3.8 SPF雞胚中sc Fv的活性研究
        2.4 討論
            2.4.1 scFv的篩選
            2.4.2 scFv的純化
            2.4.3 scFv的活性研究
        2.5 小結(jié)
    第三章 TAT-scFv重組穿梭胞內(nèi)抗體的制備及活性研究
        3.1 材料
            3.1.1 細(xì)菌、細(xì)胞及病毒
            3.1.2 主要試劑和儀器
        3.2 方法
            3.2.1 引物設(shè)計與合成
            3.2.2 scFv基因的擴(kuò)增及目的片段回收
            3.2.3 scFv基因和質(zhì)粒pMD-18T的連接
            3.2.4 pMD-18T-scFv質(zhì)粒和pET-28(a)-TAT質(zhì)粒的雙酶切、回收及連接
            3.2.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
            3.2.6 pET-28(a)-TAT-scFv重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定
            3.2.7 TAT-scFv重組表達(dá)菌的制備
            3.2.8 目的蛋白TAT-scFv的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
            3.2.10 TAT-scFv表達(dá)菌的中試發(fā)酵
            3.2.11 TAT-scFv重組蛋白的初步純化
            3.2.12 TAT-scFv重組蛋白的精純
            3.2.13 TAT-scFv的 WB鑒定和免疫結(jié)合活性分析
            3.2.14 細(xì)胞水平TAT-scFv的活性研究
            3.2.15 SPF雞胚中sc Fv的活性研究
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 scFv基因的擴(kuò)增
            3.3.2 pET-28(a)-TAT-scFv重組質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定
            3.3.3 重組蛋白TAT-scFv的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析
            3.3.4 重組菌表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果
            3.3.5 TAT-scFv重組蛋白的初步純化
            3.3.6 TAT-scFv重組蛋白的精純
            3.3.7 TAT-scFv的 WB鑒定和免疫結(jié)合活性分析
            3.3.8 細(xì)胞水平TAT-scFv重組穿梭胞內(nèi)抗體的活性研究
            3.3.9 SPF雞胚中TAT-scFv的活性研究
        3.4 討論
            3.4.1 TAT細(xì)胞跨膜蛋白
            3.4.2 TAT-scFv對三種H3N2 流感病毒抑制作用
        3.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡介
致謝



本文編號：3747768