雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)是冠狀病毒科Gamma冠狀病毒屬的成員,其引起的雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是雞的一種急性高度接觸傳染性呼吸道疾病。IBV基因組容易變異,導(dǎo)致病毒血清型和致病性多樣化,各血清型之間交叉保護(hù)作用有限,給養(yǎng)禽業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,做好該病的防控具有極其重要的意義。IBV感染致病與免疫機(jī)制是IB防控研究的主要方向之一。天然(固有)免疫反應(yīng)是宿主抵御病毒感染的第一道防線,在宿主防御IBV中起重要作用。研究表明冠狀病毒調(diào)控天然免疫反應(yīng)具有多樣性和復(fù)雜性,導(dǎo)致冠狀病毒致病性和免疫性的差異,不同IBV毒株對不同組織的致病性可能與病毒引起的固有免疫反應(yīng)有關(guān)。因此,深入研究不同致病性IBV感染宿主后不同靶組織的天然免疫反應(yīng)具有重要意義。IBV有多種臨床致病型,其中呼吸型和腎型為兩種主要的致病型。本課題應(yīng)用不同血清型的呼吸型和腎型IBV毒株分別感染SPF雞,并對感染雞氣管和腎臟TLR3和TLR7信號通路進(jìn)行研究,同時研究此兩種IBV感染對核轉(zhuǎn)錄因子IRF7和NF-...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮寫詞對照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 IBV研究進(jìn)展
        1.1.1 IBV概述
        1.1.2 IBV基因組
        1.1.3 IBV結(jié)構(gòu)蛋白
        1.1.4 IBV復(fù)制
        1.1.5 IBV的致病性
    1.2 天然免疫研究進(jìn)展
        1.2.1 模式識別受體及其信號通路
            1.2.1.1 TLR信號通路
            1.2.1.2 RLR信號通路
            1.2.1.3 NLR信號通路
        1.2.2 核轉(zhuǎn)錄因子
            1.2.2.1 IRF7
            1.2.2.2 NF-κB
        1.2.3 細(xì)胞因子
            1.2.3.1 促炎癥因子
            1.2.3.2 趨化因子
            1.2.3.3 Ⅰ型IFN
        1.2.4 ISG
            1.2.4.1 Viperin
            1.2.4.2 IFIT5
    1.3 IBV天然免疫應(yīng)答研究進(jìn)展
    1.4 本研究目的和意義
第二章 IBV感染對雞氣管和腎臟TLR3和TLR7信號通路的影響
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒
        2.1.2 SPF雞胚和雞
        2.1.3 主要試劑和抗體
        2.1.4 主要儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 病毒增殖與EID50測定
        2.2.2 IBV人工感染SPF雞
        2.2.3 樣品采集與處理
        2.2.4 組織病理學(xué)觀察
            2.2.4.1 組織切片制備
            2.2.4.1 蘇木素-伊紅染色
        2.2.5 RNA抽提
        2.2.6 反轉(zhuǎn)錄
        2.2.7 引物設(shè)計與合成
        2.2.8 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
            2.2.8.1 PCR擴(kuò)增目的基因
            2.2.8.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和克隆
            2.2.8.3 陽性質(zhì)粒抽提
            2.2.8.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
        2.2.9 熒光定量PCR檢測
        2.2.10 ELISA檢測
        2.2.11 Western Blot檢測
        2.2.12 免疫組織化學(xué)檢測
        2.2.13 數(shù)據(jù)處理與分析
    2.3 試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 IBV感染后SPF雞臨床癥狀、剖檢病變與死亡情況
        2.3.2 IBV感染后SPF雞氣管黏膜和腎臟組織病理變化
        2.3.3 IBV感染后SPF雞氣管黏膜和腎臟組織病毒載量變化
        2.3.4 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織TLR3和TLR7及其接頭分子mRNA表達(dá)的影響
        2.3.5 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織TLR3蛋白表達(dá)的影響
        2.3.6 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織TLR3蛋白分布的影響
        2.3.7 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織信號通路關(guān)鍵分子mRNA表達(dá)的影響
        2.3.8 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織促炎癥和抗炎癥細(xì)胞因子mRNA和蛋白表達(dá)的影響
        2.3.9 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織I型IFN mRNA和蛋白表達(dá)的影響
        2.3.10 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織ISG mRNA表達(dá)的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 IBV感染對雞氣管和腎臟對核轉(zhuǎn)錄因子IRF7和NF-κB p65表達(dá)的影響
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 病毒
        3.1.2 SPF雞胚和SPF雞
        3.1.3 質(zhì)粒
        3.1.4 抗體
        3.1.5 主要試劑
        3.1.6 主要儀器
        3.1.7 蛋白純化及復(fù)性溶液
            3.1.7.1 包涵體蛋白純化試劑
            3.1.7.2 包涵體蛋白復(fù)性液
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 雞IRF7蛋白多克隆抗體制備
            3.2.1.1 引物設(shè)計與合成
            3.2.1.2 PCR擴(kuò)增雞IRF7基因
            3.2.1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和克隆
            3.2.1.4 構(gòu)建雞IRF7原核表達(dá)質(zhì)粒
            3.2.1.5 雞IRF7蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定
            3.2.1.6 雞IRF7蛋白純化和復(fù)性
            3.2.1.7 免疫兔子制備抗體及血清分離
        3.2.2 IBV人工感染SPF雞
        3.2.3 樣品采集與處理
        3.2.4 RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄
        3.2.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
        3.2.6 熒光定量PCR檢測
        3.2.7 Western Blot檢測
        3.2.8 免疫組織化學(xué)檢測
        3.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 雞IRF7原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.2 雞IRF7原核蛋白的表達(dá)與純化
        3.3.3 雞IRF7蛋白多抗的反應(yīng)性檢測結(jié)果
        3.3.4 IBV感染對SPF雞氣管黏膜和腎臟組織IRF7和NF-κB p65 mRNA表達(dá)的影響
        3.3.5 IBV感染對SPF雞氣管和腎臟組織IRF7蛋白表達(dá)的影響
        3.3.6 IBV感染對SPF雞氣管和腎臟組織IRF7蛋白分布的影響
        3.3.7 IBV感染對SPF雞氣管組織NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響
        3.3.8 IBV感染對SPF雞氣管和腎臟組織NF-κB p65蛋白分布的影響
        3.3.9 IBV感染后SPF雞氣管和腎臟組織IBV N蛋白表達(dá)變化
        3.3.10 IBV感染后SPF雞氣管黏膜和腎臟組織IBV N蛋白表達(dá)的分布
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 Viperin和IFIT5對IBV體外復(fù)制的影響
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 雞胚、細(xì)胞和病毒
        4.1.2 質(zhì)粒
        4.1.3 抗體
        4.1.4 主要試劑
        4.1.5 主要儀器
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 CEK細(xì)胞的制備與培養(yǎng)
        4.2.2 IBV在CEK細(xì)胞上的適應(yīng)與增殖
        4.2.3 TCID50測定
        4.2.4 IBV感染DF1細(xì)胞
        4.2.5 shRNA干擾序列篩選
        4.2.6 shRNA慢病毒制備
        4.2.7 穩(wěn)定表達(dá)shRNA DF1細(xì)胞的篩選
        4.2.8 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒
            4.2.8.1 引物設(shè)計與合成
            4.2.8.2 雞Viperin和IFIT5基因的擴(kuò)增
            4.2.8.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和克隆
            4.2.8.4 擴(kuò)增產(chǎn)物同源重組連接pEGFP N1載體
        4.2.9 質(zhì)粒抽提
        4.2.10 轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞
        4.2.11 RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄
        4.2.12 熒光定量PCR檢測
        4.2.13 Western Blot檢測
        4.2.14 間接免疫熒光(IFA)檢測
        4.2.15 數(shù)據(jù)處理與分析
    4.3 試驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 IBV M41和GX-YL5毒株在CEK細(xì)胞上的適應(yīng)與增殖
        4.3.2 IBV M41和GX-YL5毒株感染CEK細(xì)胞上調(diào)Viperin和IFIT5 mRNA表達(dá)
        4.3.3 IBV M41和GX-YL5毒株在DF1細(xì)胞上的感染和復(fù)制
        4.3.4 IBV M41和GX-YL5毒株感染DF1細(xì)胞上調(diào)Viperin和IFIT5 mRNA表達(dá)
        4.3.5 瞬時過表達(dá)Viperin對IBV復(fù)制的影響
            4.3.5.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-Viperin的構(gòu)建
            4.3.5.2 DF1細(xì)胞中瞬時過表達(dá)雞Viperin蛋白
            4.3.5.3 過表達(dá)Viperin蛋白抑制IBV在DF1細(xì)胞的復(fù)制
        4.3.6 瞬時過表達(dá)IFIT5對IBV復(fù)制的影響
            4.3.6.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-IFIT5的構(gòu)建
            4.3.6.2 DF1細(xì)胞中瞬時過表達(dá)雞IFIT5蛋白
            4.3.6.3 過表達(dá)IFIT5蛋白抑制IBV在DF1細(xì)胞的增殖
        4.3.7 shRNA慢病毒敲低Viperin mRNA表達(dá)對IBV復(fù)制的影響
            4.3.7.1 篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Viperin shRNA的DF1細(xì)胞
            4.3.7.2 三種Viperin shRNA DF1細(xì)胞干擾效果評價
            4.3.7.3 敲低DF1細(xì)胞Viperin mRNA表達(dá)促進(jìn)IBV的感染
        4.3.8 shRNA慢病毒敲低IFIT5 mRNA表達(dá)對IBV復(fù)制的影響
            4.3.8.1 篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)IFIT5 shRNA的DF1細(xì)胞
            4.3.8.2 三種IFIT5 shRNA DF1細(xì)胞干擾效果評價
            4.3.8.3 敲低DF1細(xì)胞IFIT5 mRNA表達(dá)促進(jìn)IBV的感染
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論
本研究創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況及參加科研項目



本文編號：3747022