流產(chǎn)嗜性衣原體(Chlamydophila abortus, C. abortus)是引起豬、牛、羊等家畜流產(chǎn)、死胎等繁殖系統(tǒng)疾病的重要病原體,每年給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí),作為一種重要的人畜共患病原體,也給人類的公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重的危害。近幾年來(lái)的豬場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,我國(guó)豬場(chǎng)中衣原體流行相當(dāng)普遍。目前,豬場(chǎng)中都沒(méi)有使用衣原體疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防,因此檢測(cè)血清中抗體可以作為該病臨床診斷的重要依據(jù)。因此,本研究利用重組MOMP蛋白和單克隆抗體建立一種快速、簡(jiǎn)便的阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法,為臨床檢測(cè)提供技術(shù)支持。1.豬流產(chǎn)嗜性衣原體MOMP克隆表達(dá) 以豬流產(chǎn)嗜性衣原體HB1043株的全基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增得到全長(zhǎng)的MOMP基因,連接T載體并測(cè)序。對(duì)基因序列進(jìn)行分析后,選擇271-1176bp進(jìn)行克隆表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MOMP,轉(zhuǎn)化BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并采用鎳離子親合層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物純化,得到34kDa的重組蛋白,經(jīng)Western-Blot檢測(cè)證實(shí)重組蛋白具有免疫學(xué)活性。 2. MOMP單克隆抗體制備 使用甲醛滅活的衣原體...

【文章頁(yè)數(shù)】：48 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 前言
    1.1 衣原體概述
        1.1.1 衣原體分類
        1.1.2 主要生理特性
        1.1.3 衣原體危害
    1.2 豬流產(chǎn)嗜性衣原體病研究進(jìn)展
        1.2.1 臨床癥狀及病理變化
        1.2.2 治療與預(yù)防
        1.2.3 主要抗原蛋白研究進(jìn)展
        1.2.4 流行病學(xué)
    1.3 豬流產(chǎn)嗜性衣原體檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.1 傳統(tǒng)檢測(cè)
        1.3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)
        1.3.3 血清學(xué)檢測(cè)
    1.4 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 病原、血清、細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 試劑配制
        2.1.4 主要儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 豬流產(chǎn)嗜性衣原體MOMP克隆表達(dá)
        2.2.2 MOMP單克隆抗體制備
        2.2.3 單克隆抗體酶標(biāo)
        2.2.4 阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法建立
3 結(jié)果與分析
    3.1 MOMP克隆表達(dá)結(jié)果
        3.1.1 目的基因擴(kuò)增及分析
        3.1.2 誘導(dǎo)表達(dá)與純化
        3.1.3 Western-Blot檢測(cè)
        3.1.4 間接ELISA包被濃度與血清稀釋度選擇
        3.1.5 臨界值確定
    3.2 MOMP單克隆抗體制備
        3.2.1 小鼠免疫后效價(jià)檢測(cè)
        3.2.2 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)
        3.2.3 型分析
        3.2.4 腹水效價(jià)檢測(cè)
        3.2.5 腹水純化
    3.3 單抗酶標(biāo)
    3.4 阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法建立
        3.4.1 參考血清效價(jià)檢測(cè)
        3.4.2 抗原包被及酶標(biāo)單抗工作濃度選擇
        3.4.3 血清稀釋度選擇
        3.4.4 酶標(biāo)單抗反應(yīng)時(shí)間
        3.4.5 血清反應(yīng)時(shí)間
        3.4.6 臨界值確定
        3.4.7 交叉反應(yīng)
        3.4.8 重復(fù)性
        3.4.9 符合性
        3.4.10 穩(wěn)定性
4 討論
    4.1 抗原蛋白的選擇
    4.2 表達(dá)載體的選擇
    4.3 單克隆抗體制備
    4.4 阻斷ELISA方法
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄1
附錄2
致謝



本文編號(hào)：3745464