借助于高通量測(cè)序技術(shù)、GWAS等組學(xué)分析技術(shù),挖掘與家畜優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀及抗逆性狀相關(guān)的功能基因,進(jìn)而在常規(guī)育種方法技術(shù)的基礎(chǔ)上,利用分子育種技術(shù),加快育種進(jìn)程,提高家畜育種水平,變得愈來愈具有可能。特別是近年來,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,使得育種者在家畜基因組上定點(diǎn)、精確、高效地進(jìn)行特定基因的精準(zhǔn)編輯,從而使得動(dòng)物的表型向著人們期望的目標(biāo)變化成為現(xiàn)實(shí)。同時(shí),有可能實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)定點(diǎn)精準(zhǔn)編輯,在表型上實(shí)現(xiàn)聚合效應(yīng),縮短育種周期,提高育種效果。本研究在細(xì)胞水平、胚胎水平首先分別驗(yàn)證了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的基因敲除效率,之后,通過將Cas9 mRNA與6條分別針對(duì)MSTN、ASIP和BCO2三個(gè)基因CDS區(qū)的靶向sgRNA同時(shí)注射到1細(xì)胞期受精卵的胞質(zhì)中,經(jīng)體外培養(yǎng)與胚胎移植,成功獲得了多基因敲除灘羊,并對(duì)基因敲除羊的敲除情況、脫靶效應(yīng)、遺傳性以及表型進(jìn)行了系統(tǒng)分析。主要研究結(jié)果如下:1.成纖維細(xì)胞上的編輯效率驗(yàn)證。分別針對(duì)每個(gè)基因的CDS區(qū)設(shè)計(jì)兩個(gè)sgRNA,構(gòu)建細(xì)胞表達(dá)載體,與Cas9細(xì)胞表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。對(duì)比單sgRNA敲除策略和雙sgR...

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的起源
        1.1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.1.2 基因編輯原理與技術(shù)
    1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
    1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的缺陷
    1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.4.1 利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)基因編輯
        1.4.2 dCas9
        1.4.3 利用CRISPR/Cas9進(jìn)行高通量篩選
        1.4.4 CRISPR/Cas9的其他應(yīng)用
    1.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動(dòng)物遺傳育種方面的應(yīng)用
        1.5.1 提供相關(guān)疾病模型
        1.5.2 提高動(dòng)物生產(chǎn)性能
    1.6 研究目的與意義
第二章 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)介導(dǎo)的多基因敲除灘羊的制備與評(píng)價(jià)
    2.1 材料方法
        2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 構(gòu)建sgRNA的細(xì)胞表達(dá)載體
        2.1.3 利用T7EI酶切分析檢測(cè)細(xì)胞
        2.1.4 T-A單克隆測(cè)序鑒定突變基因型
        2.1.5 Off-target檢測(cè)
        2.1.6 Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄
        2.1.7 sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄
        2.1.8 受精卵胞質(zhì)注射及胚胎移植
        2.1.9 胚胎基因敲除效率檢測(cè)
        2.1.10 羔羊基因敲除效率檢測(cè)
        2.1.11 基因敲除灘羊組織基因敲除情況檢測(cè)
        2.1.12 基因敲除灘羊Off-target檢測(cè)
        2.1.13 基因敲除灘羊遺傳性分析
        2.1.14 免疫熒光分析
        2.1.15 BCO2基因敲除灘羊脂肪顏色鑒定
        2.1.16 BCO2基因敲除灘羊脂肪組織靶基因基因分型及轉(zhuǎn)錄情況分析
        2.1.17 蛋白質(zhì)印跡分析
        2.1.18 H&E染色
        2.1.19 透射電鏡分析
        2.1.20 灘羊羔羊的體重測(cè)定
        2.1.21 灘羊羔羊的血液生化指標(biāo)檢測(cè)
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 細(xì)胞基因敲除效率驗(yàn)證
        2.2.2 胚胎基因敲除效率驗(yàn)證
        2.2.3 個(gè)體基因敲除效率驗(yàn)證
        2.2.4 基因敲除灘羊組織敲除情況分析
        2.2.5 基因敲除灘羊脫靶效應(yīng)檢測(cè)
        2.2.6 基因敲除雄性羔羊遺傳性分析
        2.2.7 基因敲除灘羊的表型分析
    2.3 討論
    2.4 研究結(jié)論
    2.5 創(chuàng)新點(diǎn)
    2.6 下一步的研究?jī)?nèi)容
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3742489