雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IB可感染所有日齡的雞并且還常常引起支原體混合感染以及大腸桿菌等繼發(fā)感染從而增加雞群的死亡率,給養(yǎng)雞業(yè)生產帶來巨大的損失。目前,該病呈世界性流行,是嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一。IBV基因組容易發(fā)生變異導致其血清型眾多,不同血清型之間交叉保護力弱,給本病防治帶來很大的困難。因此探索快速、靈敏、特異的抗體檢測和病原診斷方法已成為當前迫切需要解決的難題。當前IBV抗體血清學檢測方法中,ELISA因具有快速、簡便、準確、特異的特點被廣泛采用并已被國際獸疫局(OIE)確定為標準方法。當前商品化的IBV抗體檢測試劑盒大多采用全病毒粒子包被,對不同血清型的地方毒株的交叉反應性差異較大,加上活病毒純化困難且存在散播病毒的危險性及檢測成本高,使得商品化IBV抗體檢測試劑盒的應用受到限制。IBV傳統(tǒng)的病原診斷方法雖然準確,但操作復雜、耗時、費力,其它的核酸診斷方法如核酸探針雜交、RT-PCR、...

【文章頁數】：62 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表 Abbreviations
第一章 文獻綜述
    1.1 雞傳染性支氣管炎概述
    1.2 雞傳染性支氣管炎抗體的檢測技術
        1.2.1 對流免疫電泳(CIE)
        1.2.2 瓊脂擴散沉淀試驗(AGP)
        1.2.3 間接血凝抑制試驗(PHA)
        1.2.4 免疫熒光抗體技術(IFA)
        1.2.5 病毒中和試驗(VNT)
        1.2.6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
    1.3 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)
    1.4 本課題的研究目的與意義
第二章 利用IBV重組N蛋白建立間接N-ELISA抗體檢測試劑盒的研究
    2.1 材料和操作步驟
        2.1.1 材料
        2.1.2 主要試劑的配制方法
        2.1.3 主要儀器設備及耗材
        2.1.4 操作步驟
    2.2 實驗方法
        2.2.1 批內重復性試驗
        2.2.2 批間重復性試驗
        2.2.3 37℃加速老化試驗
        2.2.4 符合性試驗
        2.2.5 4℃和-20℃恒溫保存試驗
        2.2.6 阻斷試驗
        2.2.7 間接ELISA試劑盒的陰陽性判斷標準的建立
        2.2.8 臨床樣品血清的檢測
    2.3 結果
        2.3.1 批內重復性試驗檢測結果
        2.3.2 批間重復性試驗檢測結果
        2.3.3 37℃加速試驗老化結果
        2.3.4 符合性試驗結果
        2.3.5 保存期試驗結果
        2.3.6 阻斷試驗結果
        2.3.7 間接ELISA試劑盒陰陽性臨界值的確定
        2.3.8 臨床血清樣品的檢測結果
            2.3.8.1 IBV廣西地方分離毒株制備的單價油苗免疫后的血清檢測結果
            2.3.8.2 養(yǎng)殖公司送檢血清樣品檢測結果
        2.3.9 間接N-ELISA試劑盒和IDEXX試劑盒敏感性比較結果
    2.4 小結與討論
    2.5 試劑盒使用說明
第三章 反轉錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)快速檢測IBV方法的建立
    3.1 材料和方法
        3.1.1 毒株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 引物的設計與合成
    3.2 LAMP檢測方法條件的優(yōu)化
        3.2.0 引物的驗證
        3.2.1 反應溫度的優(yōu)化
        3.2.2 反應時間的優(yōu)化
        3.2.3 甜菜堿濃度的優(yōu)化
        3.2.4 硫酸鎂濃度的優(yōu)化
        3.2.5 dNTP濃度的優(yōu)化
        3.2.6 兩對引物的優(yōu)化比例
        3.2.7 特異性實驗
        3.2.8 敏感性試驗
        3.2.9 重復性和穩(wěn)定性檢測
            3.2.9.1 批內重復性試驗
            3.2.9.2 批間重復性試驗
        3.2.10 陰陽性的可視化
        3.2.11 臨床樣品的檢測
        3.2.12 反應最終優(yōu)化體系成份終濃度表
    3.3 結果
        3.3.1 引物的驗證
        3.3.2 反應溫度的優(yōu)化
        3.3.3 反應時間的優(yōu)化
        3.3.4 甜菜堿濃度的優(yōu)化
        3.3.5 硫酸鎂濃度的優(yōu)化
        3.3.6 dNTP濃度的優(yōu)化
        3.3.7 兩對引物比例優(yōu)化
        3.3.8 特異性試驗
        3.3.9 敏感性試驗
        3.3.10 重復性和穩(wěn)定性檢測
        3.3.11 陰陽性的可視化結果
        3.3.12 臨床樣品檢測結果
        3.3.13 反應最終優(yōu)化體系終濃度
    3.4 討論
第四章 結論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況及參與的科研項目



本文編號：3736343