研究背景腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC) O157:H7是一種重要的人畜共患病原菌,抗生素治療可能會加劇溶血性尿毒綜合癥(haemolutic uraemic syndrome, HUS)。所以發(fā)展疫苗是控制EHEC O157:H7在動物腸道定居繁殖和預(yù)防人感染及其并發(fā)癥的最有效手段。 研究目的EHEC O157:H7的致病因子主要有粘附相關(guān)因子、毒素和溶血素等,這些組分以及它們的全分子或部分結(jié)構(gòu)是目前最重要的保護(hù)性抗原的篩選目標(biāo)。本研究擬用生物信息學(xué)的方法,以str.k12MG1655非致病性大腸桿菌為比對模板,篩選5株EHEC O157:H7菌株內(nèi)保守性的定位外膜和胞外的差異編碼序列,應(yīng)用大腸桿菌原核表達(dá)技術(shù)制備篩選出的蛋白。分別應(yīng)用細(xì)胞水平的黏附模型、動物水平的免疫與保護(hù)力效力試驗等,篩選與鑒定了EHEC O157:H7有效保護(hù)性抗原,并探討了免疫作用機(jī)制,為新型疫苗的研制提供了實踐基礎(chǔ)。 研究方法首先從NCBI網(wǎng)站GenBank上查到MG1655、EDL933、Sakai、EC4115、 TW14359和Xuzhou21等6個毒株...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
前言
    0.1. 研究背景
    0.2. EHEC疫苗的研究進(jìn)展
    0.3. 反向疫苗學(xué)
    0.4. 研究目的與意義
第一章 EHEC 0157：H7保護(hù)性抗原的篩選
    1.1 方法
        1.1.1 基因組序列和氨基酸序列查找
        1.1.2 ORF的預(yù)測和差異分析
        1.1.3 亞細(xì)胞定位
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 大腸桿菌MG1655、EDL933、Sakai、EC4115、TW14359和Xuzhou21六株的基因及其編碼序列
        1.2.2 ORF的預(yù)測和差異分析
        1.2.3 抗原的篩選
        1.2.4 亞細(xì)胞定位
    1.3 討論
第二章 抗原基因的克隆、表達(dá)與純化
    2.1 材料
        2.1.1 載體與菌株
        2.1.2 試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 目的基因的擴(kuò)增
        2.2.2 目的基因的克隆、轉(zhuǎn)化和酶切鑒定
        2.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-espA和pET22b(+)-espB的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與鑒定
        2.2.4 重組表達(dá)型基因工程菌的構(gòu)建
        2.2.5 重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測
        2.2.6 重組蛋白的大量表達(dá)、親和層析純化
        2.2.7 Western Blotting鑒定重組蛋白
        2.2.8 目的蛋白多抗血清的制備
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PCR目的基因的擴(kuò)增和克隆
        2.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-目的基因的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與鑒定
        2.3.3 基因重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及融合蛋白的鑒定
    2.4 討論
        2.4.1 目標(biāo)基因的擴(kuò)增
        2.4.2 工程菌蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4.3 大腸桿菌表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.4.4 重組融合蛋白純化條件的優(yōu)化
第三章 抗原蛋白在小鼠體內(nèi)免疫保護(hù)性的初步檢測
    3.1 試驗材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 試驗動物
    3.2 試驗方法
        3.2.1 目的蛋白的免疫原性分析
        3.2.2 免疫小鼠的攻毒保護(hù)試驗
        3.2.3 小鼠的高劑量攻毒
        3.2.4 ELISA分析蛋白免疫小鼠血清中抗體亞型
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 目的蛋白的免疫原性分析
        3.3.2 10MLD攻毒后小鼠的觀察
        3.3.3 50MLD和100MLD攻毒后小鼠的觀察
        3.3.4 Paa免疫組小鼠血清抗體亞型的測定
    3.4. 討論
第四章 新型蛋白Paa、Z0390、Z4191及Z1211在功能上的探索研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株,質(zhì)粒及培養(yǎng)基
        4.1.2 生化與分子生物寫試劑
        4.1.3 其他耗材及儀器
    4.2 方法
        4.2.1 Paa、Z0390以及Z4191小鼠血清抗EHEC 0157：H7黏附Hep-2細(xì)胞檢測
        4.2.2 Paa免疫組受試動物的排菌量監(jiān)測
        4.2.3 Z0390以及Z1211自轉(zhuǎn)運(yùn)功能的驗證
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 Paa、Z0390及Z4191細(xì)胞水平的黏附測定
        4.3.2 Paa小鼠攻毒后的排菌量監(jiān)測
        4.3.3 Z0390和Z1211自轉(zhuǎn)運(yùn)功能的驗證
    4.4 討論
第五章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
英文縮略詞表
致謝
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