發(fā)布時間：2023-02-03 17:55

　　近年來,CRISPR/Cas9技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動物基因編輯領(lǐng)域,與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比較,CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計更簡單、靶向效率更高、位點特異性更強,適用于進行大規(guī)模的動物基因編輯。但是,CRISPR/Cas9技術(shù)制備的基因編輯動物可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng),通過CRISPR/Cas9體系顯微注射的方式對牛羊等大型單胎動物進行編輯的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在多胎動物上進行編輯的效率。為了進一步提高對山羊等大型單胎動物進行基因編輯的效率、減少甚至消除CRISPR/Cas9系統(tǒng)引起的脫靶效應(yīng),我們以靶向山羊FGF5基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例,對大動物基因編輯過程進行了優(yōu)化。本研究主要通過對sgRNA的設(shè)計過程、胚胎注射CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組分和基因打靶策略三個層面對大動物基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行了優(yōu)化,得到了可用于對山羊FGF5基因進行靶向敲除的高效率、無脫靶效應(yīng)的sgRNA,獲得了可用于山羊胚胎微注射體系的最適濃度,發(fā)現(xiàn)了多基因打靶策略可大大提高山羊基因打靶的效率和獲得純合陽性編輯個體的可能。試驗過程和主要結(jié)果如下:1.sgRNA設(shè)計的優(yōu)化。首先對目前已公布的、可設(shè)計... 

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)及基因編輯羊的研究進展
    1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究進展
        1.1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展簡史
        1.1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯類型
        1.1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在羊上的研究
        1.2.1 羊的相關(guān)功能基因的介紹
        1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在羊上的應(yīng)用
        1.2.3 基因編輯羊存在的問題
    1.3 研究目的和意義
        1.3.1 降低基因編輯羊的脫靶效應(yīng)
        1.3.2 提高山羊的基因編輯效率和純合率
第二章 山羊sgRNA設(shè)計的優(yōu)化
    2.1 方法
        2.1.1 對比sgRNA設(shè)計軟件
        2.1.2 設(shè)計sgRNA
        2.1.3 sgRNA的篩選
        2.1.4 構(gòu)建U6-sgRNA載體
        2.1.5 細(xì)胞藥物篩選濃度的確定
        2.1.6 U6-sgRNA和Cas9載體的轉(zhuǎn)染
        2.1.7 檢測編輯效率
        2.1.8 檢測sg8脫靶效應(yīng)
        2.1.9 單克隆測序
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 sgRNA設(shè)計
        2.2.2 稻瘟菌素和嘌呤霉素篩選濃度
        2.2.3 sgRNA編輯效率的檢測
        2.2.4 脫靶效應(yīng)檢測
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 山羊CRISPR系統(tǒng)微注射組分的優(yōu)化
    3.1 方法
        3.1.1 供試羊處理
        3.1.2 T7-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建
        3.1.3 Cas9mRNA體外轉(zhuǎn)錄
        3.1.4 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄
        3.1.5 配制微注射溶液
        3.1.6 胚胎回收及顯微注射
        3.1.7 提取基因組DNA
        3.1.8 檢測編輯效率
        3.1.9 檢測脫靶效應(yīng)
        3.1.10 檢測編輯類型
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 胚胎回收及分組
        3.2.2 鑒定Cas9mRNA和sgRNA
        3.2.3 胚胎分裂率和編輯效率
        3.2.4 編輯類型檢測
        3.2.5 脫靶效應(yīng)檢測
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 基因編輯山羊打靶策略和效果的研究
    4.1 方法
        4.1.1 制備基因編輯羊
        4.1.2 編輯效率檢測
        4.1.3 單克隆測序
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 羔羊存活數(shù)
        4.2.2 編輯效率檢測
        4.2.3 編輯類型檢測
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 結(jié)論
    5.1 研究結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 下一步研究內(nèi)容
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)[J]. 尹珅,賀桂芳,賴方秾,謝鳳云,馬俊宇.  生物技術(shù)通報. 2016(03)
[2]Identification of Sheep Ovary Genes Potentially Associated with Off-season Reproduction[J]. Hugh T.Blair,Runlin Z.Ma.  遺傳學(xué)報. 2012(04)



本文編號：3734644