本文關(guān)鍵詞：雞源CD40L的體外表達(dá)及其生物活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有生物學(xué)活性的雞源CD40L,應(yīng)用于新城疫Lasota疫苗的免疫,探討其免疫增強(qiáng)作用。方法：依據(jù)畢赤酵母對于密碼子的偏好性,對雞源CD40L基因進(jìn)行優(yōu)化,為了利于后期純化,我們在序列上添加6×His標(biāo)簽(CAC CAC CAC CAC CAC CAC),人工合成重組質(zhì)粒pwPICZalpha-Chicken-CD40L;將重組質(zhì)粒線性化后,電擊轉(zhuǎn)入酵母,設(shè)計特異性引物雞源CD40L-F和雞源CD40L-R驗證重組質(zhì)粒是否成功導(dǎo)入酵母,選取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá);表達(dá)上清經(jīng)SDS-PAGE及Anti 6-His抗體驗證;將蛋白產(chǎn)物經(jīng)過Ni-NTA Resin柱、透析、陽離子柱及濃縮等操作,獲得較高純度的雞源CD40L二聚體蛋白;對該蛋白進(jìn)行還原性、非還原性以及去糖基化處理,用SDS-PAGE和Western blot試驗驗證蛋白表達(dá)過程中是否發(fā)生此類變化;將表達(dá)的蛋白按1μg/羽和0.1μg/羽的劑量與新城疫Lasota疫苗共同作用于雞,驗證其免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果：1、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pwPICZalpha-bi-Chicken-CD40L;2、轉(zhuǎn)化子DNA及PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證重組酵母構(gòu)建成功；3、成功表達(dá)雞源CD40L二聚體蛋白,并通過兩步純化過程得到純凈產(chǎn)物；4、SDS-PAGE 及 Western blot驗證蛋白在表達(dá)過程中發(fā)生了糖基化;5、將CD40L與新城疫Lasota疫苗配合免疫于雞體后,通過檢測機(jī)體抗體水平、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)以及丙二醛(MDA)等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)雞源CD40L二聚體蛋白無明顯的免疫增效作用。結(jié)論：本試驗運(yùn)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)雞源CD40L二聚體蛋白,并證實在1μg/羽和O.1μg/、羽的使用劑量下,雞源CD40L蛋白對于雞新城疫Lasota疫苗無明顯的免疫增強(qiáng)作用。
【關(guān)鍵詞】：雞源CD40L蛋白 二聚體 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) 純化 免疫增效劑
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要7-8
• 文獻(xiàn)綜述8-14
• 1 Chicken-CD40L及其受體概述8-10
• 1.1 Chicken-CD40L概述8-10
• 1.2 Chicken-CD40L與其受體CD40的作用機(jī)理10
• 2 Chicken-CD40L的研究進(jìn)展10-12
• 3 免疫增效劑的發(fā)展現(xiàn)狀12-13
• 4 真核表達(dá)系統(tǒng)的概述13-14
• 前言14-15
• 試驗材料及方法15-32
• 1 試劑材料15-16
• 1.1 試驗動物、菌株及疫苗15
• 1.2 主要試劑及材料15-16
• 1.3 主要試驗儀器16
• 2 相關(guān)試劑配制16-19
• 2.1 蛋白表達(dá)所需試劑配制16-17
• 2.2 蛋白純化所需試劑配制17-18
• 2.3 疫苗的準(zhǔn)備18
• 2.4 血凝試驗(HI)及血凝抑制試驗(HA)試劑準(zhǔn)備18-19
• 3 試驗方法19-32
• 3.1 目的基因的獲得19
• 3.2 Insert Ⅰ的獲得19-21
• 3.3 Insert Ⅱ的獲得21-24
• 3.4 合成二聚體24
• 3.5 重組酵母的構(gòu)建24-25
• 3.6 重組酵母的篩選及鑒定25-26
• 3.7 重組蛋白Chicken-CD40L在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及純化26-29
• 3.8 重組蛋白Chicken-CD40L的濃縮及保存29
• 3.9 重組蛋白Chicken-CD40L生物學(xué)功能研究29-31
• 3.10 統(tǒng)計學(xué)分析31-32
• 試驗結(jié)果32-47
• 1 獲取Chicken-CD40L目的基因32-34
• 1.1 獲得Chicken-CD40L-Insert Ⅰ目的基因32
• 1.2 獲取Chicken-CD40L-Insert Ⅱ目的基因32-33
• 1.3 表達(dá)載體pwPICZalpha的回收鑒定33
• 1.4 重組質(zhì)粒pwPICZalpha-Chicken-CD40L-Insert Ⅱ的鑒定結(jié)果33
• 1.5 二聚體的合成及鑒定33-34
• 2 重組酵母的構(gòu)建、篩選與鑒定34-35
• 3 重組蛋白Chicken-CD40L的鑒定35-37
• 3.1 SDS-PAGE、Western blot驗證重組蛋白Chicken-CD40L35
• 3.2 SDS-PAGE、Western blot驗證重組蛋白Chicken-CD40L多聚體35-37
• 4 重組蛋白Chicken-CD40L的純化37-38
• 4.1 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA Resin柱分離純化結(jié)果37-38
• 4.2 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)強(qiáng)陽離子交換柱分離純化結(jié)果38
• 5 重組蛋白Chicken-CD40L的濃縮結(jié)果38-39
• 6 重組蛋白Chicken-CD40L功能驗證39-47
• 6.1 新城疫抗體效價檢測結(jié)果39-41
• 6.2 血清SOD活力測定結(jié)果41-43
• 6.3 血清GSH-PX測定結(jié)果43-45
• 6.4 血清MDA測定結(jié)果45-47
• 分析與討論47-51
• 1 重組Chicken-CD40L蛋白的真核表達(dá)47-48
• 2 重組Chicken-CD40L蛋白糖基化現(xiàn)象48-49
• 3 重組Chicken-CD40L蛋白生物學(xué)功能驗證49-51
• 全文結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• Abstract57-59
• 致謝59

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 溫慧之;雞源CD40L的體外表達(dá)及其生物活性研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 郭夏斐;鼠源REG3α和REG3α二聚體蛋白的體外表達(dá)及對人肝癌細(xì)胞的抑制作用[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：雞源CD40L的體外表達(dá)及其生物活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：373060