雞白痢作為我國農(nóng)業(yè)部要求重點監(jiān)測的14種動物疫病之一,其病原菌對禽類的危害嚴(yán)重制約著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。雞場雞白痢的凈化是根除本病的最佳方法�？股厥欠乐坞u白痢的傳統(tǒng)藥物,但由于抗生素的長期廣泛使用甚至是濫用導(dǎo)致耐藥性日益嚴(yán)重,使得雞白痢的防治和清除愈加困難。噬菌體及其裂解酶作為新型抗微生物制劑在改善食品、醫(yī)療安全等方面被廣泛研究和應(yīng)用,因此篩選鑒定高效雞白痢沙門菌的噬菌體及其裂解酶,用于雞白痢的防治和凈化具有重要意義。本研究前期分離獲得一株沙門菌噬菌體YSP2,針對裂解酶LySP2基因序列,設(shè)計并合成引物L(fēng)ySP2-ZF和LySP2-ZR,并在其5’端添加Xho I酶切位點和編碼序列AAAAGA,在其3’端插入限制性內(nèi)切酶Xba I的酶切位點。利用Xho I和Xba I分別雙酶切LySP2與載體pPICZ-αA,將目的片段連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZ-LySP2。經(jīng)Sca I單酶切線性化后,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33中,通過PCR鑒定、序列分析及Zeocin⁺抗性篩選獲得了能夠高效表達(dá)裂解酶LySP2的陽性菌株X33-pPICZ-LySP2。通過搖瓶發(fā)酵,分別對溫度、時間... 

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
前言
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 雞白痢沙門菌研究概況
        1.1 雞白痢沙門菌病的流行現(xiàn)狀
        1.2 雞白痢沙門菌病發(fā)病機(jī)理及國內(nèi)外耐藥現(xiàn)狀
        1.3 雞白痢沙門菌病的防控趨勢
    第二章 沙門菌特異性噬菌體及其裂解酶的研究進(jìn)展
        2.1 噬菌體作為抑菌劑防治沙門菌
        2.2 噬菌體應(yīng)用的流行及局限性
        2.3 裂解酶治療的應(yīng)用與發(fā)展
第二篇 研究內(nèi)容
    第一章 裂解酶LYSP2的酵母真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
        1 材料
            1.1 主要儀器
            1.2 菌株及質(zhì)粒
            1.3 試劑
            1.4 試劑配制
            1.5 引物設(shè)計與合成
        2 方法
            2.1 雞白痢沙門菌的培養(yǎng)
            2.2 沙門菌噬菌體YSP2的培養(yǎng)
            2.3 沙門菌噬菌體YSP2基因組的提取
            2.4 裂解酶LySP2基因的PCR擴(kuò)增
            2.5 表達(dá)載體pPICZ-LySP2的構(gòu)建與鑒定
            2.6 重組畢赤酵母菌株X33-pPICZ-LySP2的構(gòu)建
            2.7 重組畢赤酵母菌X33-pPICZ-LySP2的誘導(dǎo)發(fā)酵及條件優(yōu)化
            2.8 發(fā)酵上清液總蛋白濃度測定
            2.9 發(fā)酵產(chǎn)物的電泳檢測
        3 結(jié)果
            3.1 噬菌體YSP2全基因組提取結(jié)果
            3.2 重組質(zhì)粒pPICZαA-LySP2的鑒定結(jié)果
            3.3 重組質(zhì)粒pPICZα-LySP2序列測定結(jié)果
            3.4 重組酵母菌株X33-pPICZ-LySP2的構(gòu)建結(jié)果
            3.5 重組酵母菌株X33-pPICZ-LySP2的發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果
            3.6 重組畢赤酵母菌X33-pPICZ-LySP2產(chǎn)酶條件的優(yōu)化結(jié)果
            3.7 重組菌株X33-pPICZ-LySP2的誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果
            3.8 發(fā)酵產(chǎn)物的活性鑒定
            3.9 發(fā)酵上清蛋白總濃度測定
        4 討論
            4.1 噬菌體YSP2及其裂解酶LySP2
            4.2 裂解酶LySP2的表達(dá)及活性
        5 小結(jié)
    第二章 重組裂解酶體外抑菌活性及雛雞模型的治療效果
        1 材料
            1.1 重組裂解酶、實驗動物及菌株
            1.2 主要儀器
        2 方法
            2.1 平板打孔法檢測抑菌活性
            2.2 重組酵母發(fā)酵產(chǎn)物最小抑菌濃度(MIC)測定
            2.3 重組裂解酶的pH值穩(wěn)定性測試
            2.4 重組裂解酶的熱穩(wěn)定性測試
            2.5 重組裂解酶制劑的安全性測試
            2.6 雞白痢沙門菌雛雞感染模型的建立
            2.7 重組裂解酶在清除雞白痢感染雛雞模型中的療效
            2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
        3 結(jié)果
            3.1 重組裂解酶抑菌活性鑒定結(jié)果
            3.2 重組裂解酶MIC測定結(jié)果
            3.3 重組裂解酶的熱穩(wěn)定性測試結(jié)果
            3.4 重組裂解酶的pH值穩(wěn)定性測試結(jié)果
            3.5 重組裂解酶安全性檢測結(jié)果
            3.6 重組裂解酶在雞白痢感染雛雞模型中的療效
        4 討論
            4.1 裂解酶活性
            4.2 裂解酶穩(wěn)定性
            4.3 裂解酶的體內(nèi)活性
        5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
導(dǎo)師簡介
作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]李斯特菌噬菌體裂解酶的研究進(jìn)展[J]. 劉珊娜,范志華,孫溪,付榮霞,吳海清.  天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報. 2016(01)
[4]朱砂七多糖對雛雞十二指腸組織形態(tài)的影響[J]. 安樂,王娜,劉美琴,高紅霞,牟素菁,郭浩杰,劉建新,張為民,卿素珠.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2015(12)
[5]響應(yīng)面法優(yōu)化重組畢赤酵母菌表達(dá)β-甘露聚糖酶的誘導(dǎo)條件[J]. 李慧玲,劉祖艷,趙敏.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(11)
[6]動物性食品中土霉素、金霉素和四環(huán)素檢測方法研究進(jìn)展[J]. 楊琳.  中國動物檢疫. 2012(08)
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碩士論文
[1]雞白痢沙門菌噬菌體的分離鑒定及其初步應(yīng)用[D]. 袁玉玉.吉林大學(xué) 2016
[2]細(xì)菌果膠裂解酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析[D]. 劉曉肖.華南理工大學(xué) 2015
[3]雞白痢沙門氏菌菌影（Ghost）疫苗的制備及其免疫效力評價[D]. 田秋豐.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2014
[4]大腸桿菌O157 Stx噬菌體裂解酶的原核表達(dá)及活性研究[D]. 楊曦.上海交通大學(xué) 2012
[5]萊州市雞源致病性大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查與耐藥性分析[D]. 原麗麗.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號：3729810