牛腸道病毒（Bovine enteroviruses,BEV）是小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員,是引起牛臨床上以消化道和呼吸道癥狀為主要特征傳染病的病原體。盡管BEV致病性通常較低,感染后引起動物出現(xiàn)溫和的臨床癥狀,但是易與其他病原體發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染,常常導(dǎo)致牛群出現(xiàn)較高的死亡率,嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。BEV感染為國內(nèi)新發(fā)疫病,目前有關(guān)該病的發(fā)病機理及防控等眾多問題仍不清楚,缺乏研究。2012年本實驗室從國內(nèi)某地牛群暴發(fā)的臨床上以咳嗽、呼吸困難、嚴重腹瀉為主要特征、發(fā)病率和致死率分別高達50%的疫病中分離鑒定出國內(nèi)首株E種腸道病毒HY12。對HY12病毒的研究發(fā)現(xiàn),該病毒5’-UTR二級結(jié)構(gòu)與其他腸道病毒明顯不同,且病毒的TCID50可達108-9/0.1m L,進而為該病毒作為活載體遞送與表達外源抗原提供了潛在可能性。因此,為了探究HY12病毒基因組的外源序列潛在插入位點,以便為HY12表達外源抗原重組病毒的研究提供有效的技術(shù)方法與基礎(chǔ)。本研究利用分子生物學(xué)、反向遺傳學(xué)、病毒學(xué)和突變PCR等技術(shù)與方法,通過構(gòu)建HY12病毒基因組的感染性c DNA克隆并對病毒進行拯救與鑒定... 

【文章頁數(shù)】：137 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
英文縮寫詞表
引言
第一篇 文獻綜述
    第1章 腸道病毒研究進展
        1.1 腸道病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)
        1.2 腸道病毒及其分類
        1.3 腸道病毒基因結(jié)構(gòu)及功能
            1.3.1 腸道病毒基因結(jié)構(gòu)
            1.3.2 腸道病毒的 5'-UTR和 3'-UTR結(jié)構(gòu)和功能
            1.3.3 腸道病毒編碼的蛋白及其功能
        1.4 腸道病毒感染的流行情況
        1.5 腸道病毒感染與復(fù)制
        1.6 腸道病毒致病機制
    第2章 腸道病毒疫苗與載體疫苗
        2.1 腸道病毒疫苗研究概況
            2.1.1 EV-71 滅活疫苗
            2.1.2 EV-71 病毒樣顆粒（VLP）
            2.1.3 EV-71 弱毒疫苗
            2.1.4 EV-71 亞單位疫苗和合成肽疫苗
            2.1.5 CV-A16滅活疫苗
            2.1.6 CV-A16病毒樣粒子（VLP）
            2.1.7 EV-71/CV-A16二聯(lián)疫苗
            2.1.8 聯(lián)合疫苗
            2.1.9 脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）滅活疫苗與弱毒疫苗
        2.2 腸道病毒載體疫苗的研究進展
    第3章 反向遺傳學(xué)的研究
第二篇 研究內(nèi)容
    第1章 HY12-VP2蛋白單克隆抗體制備及抗原表位鑒定
        1.1 材料
            1.1.1 細胞、病毒、載體、試劑、實驗動物
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 HY12-VP2全長基因擴增與重組質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.2 HY12-VP2蛋白的表達、純化及鑒定
            1.2.3 單抗制備
            1.2.4 HY12-VP2蛋白單抗表位鑒定
            1.2.5 親本HY12-VP2亞細胞定位
            1.2.6 單抗表位的保守性分析
            1.2.7 單抗與不同BEV毒株相對應(yīng)的表位區(qū)域交叉反應(yīng)性分析
        1.3 結(jié)果
            1.3.1 重組VP2蛋白（GST-VP2）的表達
            1.3.2 抗VP2單克隆抗體的產(chǎn)生及特性
            1.3.3 單克隆抗體表位初步鑒定
            1.3.4 HY12-VP2蛋白的亞細胞定位
            1.3.5 單抗表位在不同BEV毒株中同源性分析
        1.4 討論
        1.5 小結(jié)
    第2章 HA/Flag標簽引入HY12病毒結(jié)構(gòu)蛋白重組病毒的拯救及其生物學(xué)特性鑒定
        2.1 材料
            2.1.1 細胞、病毒、載體、試劑、實驗動物
            2.1.2 主要儀器
        2.2 方法
            2.2.1 HY12毒株RNA的提取
            2.2.2 重組標簽病毒全長c DNA克隆構(gòu)建
            2.2.3 體外轉(zhuǎn)染MDBK細胞
            2.2.4 IPMA鑒定拯救的重組標簽病毒
            2.2.5 Western blot鑒定拯救的重組標簽病毒
            2.2.6 激光共聚焦
            2.2.7 血清中和實驗（SNA）
            2.2.8 電鏡觀察拯救的病毒粒子
            2.2.9 重組標簽病毒一步生長曲線和形態(tài)學(xué)觀察
            2.2.10 重組標簽病毒遺傳穩(wěn)定性
            2.2.11 重組標簽病毒與親本病毒動物感染實驗
            2.2.12 病毒核酸檢測
            2.2.13 血清抗體檢測
            2.2.14 統(tǒng)計分析
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 重組標簽病毒全長c DNA克隆構(gòu)建及其鑒定
            2.3.2 重組標簽病毒的拯救及其鑒定
            2.3.3 rHY12-VP1-HA病毒在ICR乳鼠體內(nèi)的生物學(xué)特性
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第3章 HA標簽引入HY12病毒非結(jié)構(gòu)蛋白重組病毒的拯救及其生物學(xué)特性鑒定
        3.1 材料
            3.1.1 細胞、病毒、載體、試劑、實驗動物
            3.1.2 主要儀器
        3.2 方法
            3.2.1 重組標簽病毒全長c DNA克隆構(gòu)建
            3.2.2 體外轉(zhuǎn)染MDBK細胞
            3.2.3 IPMA鑒定拯救的重組標簽病毒
            3.2.4 Western blot鑒定拯救的重組標簽病毒
            3.2.5 激光共聚焦
            3.2.6 電鏡觀察拯救的病毒粒子
            3.2.7 重組標簽病毒生長的一步曲線和蝕斑形態(tài)學(xué)觀察
            3.2.8 重組標簽病毒遺傳穩(wěn)定性
            3.2.9 重組標簽病毒在不同細胞系感染性
            3.2.10 重組標簽病毒與親本病毒動物感染實驗
            3.2.11 血清抗體檢測
            3.2.12 統(tǒng)計分析
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 重組標簽病毒全長c DNA克隆構(gòu)建及其鑒定
            3.3.2 重組標簽病毒的拯救及其鑒定
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第4章 5'-UTR對HY12病毒復(fù)制的影響
        4.1 材料
            4.1.1 細胞、病毒、載體、試劑
            4.1.2 主要儀器
        4.2 方法
            4.2.1 突變體病毒全長c DNA克隆構(gòu)建
            4.2.2 體外轉(zhuǎn)染BHK-21 細胞
            4.2.3 突變體病毒不同時間點的TCID50測定
            4.2.4 突變體病毒W(wǎng)estern blot鑒定
            4.2.5 突變體病毒蝕斑實驗
            4.2.6 突變體病毒二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
            4.2.7 統(tǒng)計分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 突變體病毒全長c DNA克隆構(gòu)建
            4.3.2 突變體病毒不同時間點TCID50測定
            4.3.3 突變體病毒W(wǎng)estern blot鑒定
            4.3.4 突變體病毒蝕斑形態(tài)
            4.3.5 突變體病毒二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
導(dǎo)師簡介
作者簡介
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雙抗體夾心ELISA檢測牛腸道病毒抗原方法的建立及流行病學(xué)調(diào)查[J]. 邢澤黎,王新平,朱利塞,魯海冰,郭昌明,蓋小春,王明月.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2016(04)
[2]從吉林省肉牛場新發(fā)疫病分離出E種腸道病毒[J]. 邢澤黎,朱利塞,王新平,李蘇靖,郭昌明,楊麗.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2014(03)
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博士論文
[1]E種腸道病毒HY12準種與進化及VP1基因突變對病毒復(fù)制的影響[D]. 朱利塞.吉林大學(xué) 2017
[2]腸道病毒分子流行病學(xué)及腸道病毒71型感染致炎癥反應(yīng)機制研究[D]. 柳楠.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2014



本文編號：3729797