口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是一種人畜共患的急性,熱性,高度接觸性的病毒性傳染病（陳溥言等2009）,主要引起偶蹄類動(dòng)物發(fā)熱,四肢、口、舌、鼻和乳房等部位形成水泡和潰爛�？谔阋卟《荆‵oot and Mouth Disease Virus, FMDV）基因組為單股正鏈RNA,可編碼12個(gè)成熟的病毒蛋白,其中VPO蛋白是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白之一,與病毒入侵細(xì)胞密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)SIFITM3蛋白具有抗病毒效果,為了進(jìn)一步探索SIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖的機(jī)制,本研究利用酵母雙雜交、細(xì)胞共定位和GST-Pull Down技術(shù)驗(yàn)證口蹄疫病毒VPO蛋白與SIFITM3蛋白間的相互作用,并通過缺失突變驗(yàn)證SIFITM3蛋白與口蹄疫病毒VPO蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)及缺失后的SIFITM3蛋白抗口蹄疫病毒功能的變化,通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SIFITM3蛋白和VP2蛋白（VPO蛋白主要亞基）,為研究蛋白間的直接相互作用奠定基礎(chǔ),主要研究?jī)?nèi)容如下： 一、FMDVVPO蛋白與SIFITM3蛋白的相互作用 通過PCR擴(kuò)增FMDV VPO基因和豬源IFI... 

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表（Abbreviations)
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 口蹄疫簡(jiǎn)介
    1.2 口蹄疫危害及流行現(xiàn)狀
    1.3 口蹄疫防治策略
    1.4 口蹄疫病毒分子特征
        1.4.1 基因組特征
        1.4.2 病毒結(jié)構(gòu)特征
    1.5 干擾素抗病毒簡(jiǎn)介
    1.6 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白IFITM家族介紹
    1.7 IFITM家族蛋白抑制病毒的機(jī)制
        1.7.1 不同包膜病毒入侵細(xì)胞的機(jī)制
        1.7.2 IFITM蛋白通過阻止病毒進(jìn)入過程抑制病毒感染
        1.7.3 IFITM蛋白通過阻止病毒粒子進(jìn)入胞漿抑制病毒感染
    1.8 IFITM蛋白在機(jī)體內(nèi)扮演的角色
    1.9 酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介
    1.10 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介
2 研究目的和意義
3 材料和方法
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞和菌株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基與抗生素及其配制
        3.1.5 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制
        3.1.6 其它緩沖液及試劑
    3.2 方法
        3.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.1.1 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
            3.2.1.2 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
            3.2.1.3 醜切產(chǎn)物回收與純化
            3.2.1.4 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
            3.2.1.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.2.1.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.1.7 質(zhì)粒的制備與鑒定
                3.2.1.7.1 質(zhì)粒的小量制備（OMEGA小提試劑盒）
                3.2.1.7.2 質(zhì)粒的大量制備（OMEGA大提試劑盒）
        3.2.2 酵母中對(duì)蛋白互作的驗(yàn)證
        3.2.3 熒光共定位實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白互作的驗(yàn)證
        3.2.4 目的蛋白原核表達(dá)及包涵體的復(fù)性
        3.2.5 GST-pull down試驗(yàn)
        3.2.6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白互作的驗(yàn)證
        3.2.7 空斑試驗(yàn)
        3.2.8 重組桿狀病毒獲得
    3.3 本研究所使用的引物
4 結(jié)果與分析
    4.1 sIFITM3與FMDV VP0的相互作用
        4.1.1 酵母雙雜交驗(yàn)證sIFITM3與FMDV VP0的相互作用
        4.1.2 細(xì)胞水平驗(yàn)證FMDV VP0與sIFITM3的相互作用
    4.2 sIFITM3不同缺失突變對(duì)FMDV增殖的影響
    4.3 桿狀病毒表達(dá)FMDV VP2蛋白和sIFITM3蛋白的研究
        4.3.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        4.3.2 重組桿粒的獲得與鑒定
        4.3.3 重組桿狀病毒的獲得及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)
        4.3.4 sIFITM3(1-165 bp)截短蛋白的原核表達(dá)及純化
5 討論
    5.1 sIFITM3蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)
    5.2 sIFITM3蛋白N端胞外區(qū)與VP0蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的互作
    5.3 sIFITM3蛋白與VP0蛋白相互作用位點(diǎn)的研究
    5.4 sIFITM3轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞對(duì)FMDV在細(xì)胞上增殖的影響
    5.5 sIFITM3基因與VP2基因重組桿狀病毒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3728681