通過對4株偽狂犬病病毒（PRV）流行株進(jìn)行比較,選擇免疫原性最高的HNQYY2012為親本株,利用CRISPR-Cas9技術(shù)和Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建帶有LoxP位點(diǎn)的HNQYY2012ΔgE/EGFP⁺,然后利用環(huán)化重組酶（Cre）去除增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因,構(gòu)建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鑒定和測序結(jié)果表明,PRV gE基因缺失株構(gòu)建成功;一步生長曲線表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于親本株,但最高滴度與親本株相近;HNQYY2012ΔgE和親本株對小鼠的半數(shù)致死量分別為10^3.8 TCID₅₀和10^2.5 TCID₅₀,表明gE基因缺失株毒力降低。制備的滅活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD₅₀和10LD₅₀強(qiáng)毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技術(shù)和Cre/loxP系統(tǒng)成功構(gòu)建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,為豬偽狂犬病滅活疫苗的研制提供了參考。 

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要試劑
    1.2 病毒和細(xì)胞
    1.3 質(zhì)粒
    1.4 實(shí)驗(yàn)動物
    1.5 方法
        1.5.1 引物設(shè)計(jì)
        1.5.2 PRV親本株篩選
        1.5.3 病毒基因組提取
        1.5.4 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        1.5.5 HNQYY2012ΔgE/EGFP+的獲得和純化
        1.5.6 HNQYY2012ΔgE株的獲得與純化
        1.5.7 HNQYY2012ΔgE株的PCR鑒定
        1.5.8 HNQYY2012株親本株與ΔgE株一步生長曲線
        1.5.9 HNQYY2012ΔgE株LD50測定
        1.5.10 豬偽狂犬病滅活疫苗(HNQYY2012ΔgE株)的制備和免疫效力試驗(yàn)
    1.6 統(tǒng)計(jì)與分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 PRV親本株篩選
    2.2 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
    2.3 重組病毒HNQYY2012ΔgE的獲得與純化
    2.4 HNQYY2012ΔgE和親本毒一步生長曲線的測定
    2.5 HNQYY2012ΔgE和親本毒LD50測定
    2.6 滅活疫苗(HNQYY201ΔgE株)的免疫效力試驗(yàn)
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建犬IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除的MDCK細(xì)胞系[J]. 徐廣軍,曹世諾,鄭君,張險(xiǎn)峰,賈洪林,鄭永輝.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(01)
[2]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)抑制EV71復(fù)制[J]. 吳濤,朱小娟,樊歡,葛以躍,陳銀,郭喜玲,趙康辰,史智揚(yáng),朱鳳才,崔侖標(biāo).  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2016 (11)
[3]應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建偽狂犬病病毒gE/TK雙缺失株[J]. 梁苑燕,胡艷芬,張小榮,陳素娟,彭大新,劉秀梵.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(11)

博士論文
[1]偽狂犬病病毒主要毒力基因功能的研究[D]. 陽愛國.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號：3727262