豬德?tīng)査跔畈《荆≒orcine deltacoronavirus,PDCoV）屬于δ冠狀病毒屬。臨床癥狀主要是引起新生仔豬產(chǎn)生嚴(yán)重的嘔吐、腹瀉和脫水,最終導(dǎo)致仔豬死亡。2014年,美國(guó)豬場(chǎng)遭受PDCoV大規(guī)模流行,經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。2016年,流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)多個(gè)省份的規(guī)�；i場(chǎng)呈PDCoV陽(yáng)性。由于目前針對(duì)PDCoV開(kāi)展的研究尚少,市場(chǎng)上暫無(wú)有效的藥物和疫苗可用。因此,PDCoV對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)具有潛在危害性,具有重要的研究?jī)r(jià)值。其中,PDCoV非結(jié)構(gòu)蛋白15（non-structural protein,nsp15）屬于尼多病毒目?jī)?nèi)切核糖核酸酶,能特異性切割雙鏈或單鏈核苷酸尿嘧啶,參與病毒復(fù)制過(guò)程,是病毒重要的毒力蛋白。本研究首次發(fā)現(xiàn)、證實(shí)并闡釋了PDCoV nsp15以二聚體發(fā)揮酶活的作用機(jī)制。提出了尼多病毒目?jī)?nèi)切核糖核酸酶的進(jìn)化假說(shuō),也為PDCoV乃至冠狀病毒的藥物設(shè)計(jì)和疫苗研發(fā)提供了思路。主要包括以下四個(gè)方面:1.PDCoV nsp15以二聚體和單體形式存在通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)、鎳離子金屬螯合親和層析（Ni-NTA）得到PDCoV nsp15（H234A）、嚴(yán)重急性呼吸綜... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表(Abbreviation)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬德?tīng)査跔畈《?PDCoV)
        1.1.1 PDCoV流行病學(xué)調(diào)查
        1.1.2 PDCoV臨床癥狀和病理特征
    1.2 PDCoV分子生物學(xué)特征
        1.2.1 PDCoV形態(tài)特征和基因組結(jié)構(gòu)
    1.3 尼多病毒概況
        1.3.1 尼多病毒的入侵、復(fù)制和釋放
        1.3.2 尼多病毒的基因組進(jìn)化
        1.3.3 尼多病毒目?jī)?nèi)切核糖核酸酶
    1.4 冠狀病毒內(nèi)切核糖核酸酶
        1.4.1 冠狀病毒內(nèi)切核糖核酸酶生物學(xué)功能
        1.4.2 冠狀病毒內(nèi)切核糖核酸酶聚集形態(tài)
    1.5 蛋白質(zhì)聚集形態(tài)分析
        1.5.1 蛋白質(zhì)的原核表達(dá)與純化
        1.5.2 分子排阻層析和分析超速離心
    1.6 熒光共振能量轉(zhuǎn)移
第二章 研究目的與意義
第三章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 基因來(lái)源
        3.1.2 菌株及質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶和主要試劑
        3.1.4 蛋白表達(dá)試劑配制
        3.1.5 核酸膠電泳緩沖液配制
        3.1.6 蛋白純化緩沖液配制
        3.1.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液及試劑
        3.1.8 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
        3.1.9 分子生物學(xué)分析軟件
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 目的基因擴(kuò)增
            3.2.1.1 nsp15 基因引物序列
            3.2.1.2 PCR擴(kuò)增條件
            3.2.1.3 PCR產(chǎn)物膠回收
            3.2.1.4 目的DNA片段與載體質(zhì)粒重組反應(yīng)
            3.2.1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞
            3.2.1.6 菌液PCR鑒定
            3.2.1.7 DH5α重組質(zhì)粒小提
            3.2.1.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞
            3.2.1.9 陽(yáng)轉(zhuǎn)質(zhì)粒表達(dá)菌株凍存
        3.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.2.1 引物
            3.2.2.2 PDCoV、SARS-CoV及 PEDV nsp15 基因PCR擴(kuò)增
            3.2.2.3 PCR產(chǎn)物CP回收
            3.2.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
            3.2.2.5 酶切目的片段與酶切載體質(zhì)粒連接反應(yīng)
            3.2.2.6 質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的測(cè)定
        3.2.3 蛋白表達(dá)與純化
            3.2.3.1 重組蛋白小量預(yù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)
            3.2.3.2 重組蛋白大量表達(dá)與純化
            3.2.3.3 SDS-PAGE檢驗(yàn)純化后蛋白
            3.2.3.4 Ni-NTA層析柱再生
            3.2.3.5 分子篩層析實(shí)驗(yàn)
            3.2.3.6 分子排阻層析分子篩
        3.2.4 分析型超高速離心實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 內(nèi)切核糖核酸酶(NendoU)體外酶活測(cè)定
        3.2.6 序列分析和結(jié)構(gòu)模擬
第四章 結(jié)果與分析
    4.1 PDCoV nsp15 蛋白表達(dá)和純化
    4.2 PDCoV nsp15 蛋白聚集形態(tài)分析
        4.2.1 SARS-CoV和 PEDV nsp15 基因克隆
        4.2.2 分子篩標(biāo)準(zhǔn)品分析
        4.2.3 蛋白質(zhì)分子排阻層析
        4.2.4 蛋白質(zhì)超速離心分析
    4.3 PDCoV nsp15 二聚體形成原因分析
        4.3.1 PDCoV nsp15 三維結(jié)構(gòu)模擬
        4.3.2 PDCoV nsp15 NTD突變體蛋白聚集形態(tài)分析
        4.3.3 SARS-CoV nsp15 突變體蛋白聚集形態(tài)分析
        4.3.4 SARS-CoV和 PDCoV nsp15 三維結(jié)構(gòu)分析
    4.4 內(nèi)切核糖核酸酶(EndoU)體外酶活功能研究
        4.4.1 PDCoV nsp15 突變體蛋白體外酶活分析
        4.4.2 SARS-CoV nsp15 突變體蛋白體外酶活分析
    4.5 NendoU和 XendoU功能結(jié)構(gòu)域保守性分析
    4.6 NendoU和 XendoU氨基酸序列同源性分析
第五章 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2012年～2016年廣東省豬丁型冠狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查及分析[J]. 宋亞兵,徐帥飛,蘇丹萍,石堅(jiān),賀東生.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(10)
[2]豬δ冠狀病毒病原學(xué)特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 莊金秋,梅建國(guó),張穎,楊麗梅,李峰.  中國(guó)動(dòng)物檢疫. 2018(01)
[3]豬Delta冠狀病毒的研究進(jìn)展[J]. 易新健,劉準(zhǔn),張翠翠,陳申秒.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(11)
[4]豬δ冠狀病毒的研究進(jìn)展[J]. 方譜縣,方六榮,董楠,肖少波.  病毒學(xué)報(bào). 2016(02)

碩士論文
[1]豬δ冠狀病毒（PDCoV）的流行病學(xué)調(diào)查與致病性研究[D]. 麥凱杰.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3723771