沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白是構(gòu)成菌體鞭毛的單體蛋白,它不僅是細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和黏附的重要組成原件,也是天然Toll樣受體5 （Toll-like receptor, TLR）的激動(dòng)劑,能夠與TLR5結(jié)合激活MyD88信號(hào)途徑,引起IL-8等細(xì)胞因子分泌增多,增強(qiáng)免疫細(xì)胞分化增殖等效應(yīng)。雖然其本身具有沙門(mén)氏菌H抗原表位區(qū)域,卻不影響其佐劑作用的發(fā)揮,甚至可作為自身佐劑增強(qiáng)鞭毛的抗原性,因此,自1998年其佐劑作用被發(fā)現(xiàn)以來(lái),一直是疫苗免疫增強(qiáng)劑的研究熱點(diǎn),多項(xiàng)研究顯示鞭毛蛋白能夠增強(qiáng)原核和真核表達(dá)蛋白抗原的抗原性,通過(guò)對(duì)天然免疫因子的調(diào)節(jié)增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答。干酪乳桿菌是安全級(jí)微生物（generally regarded as safe,GRAS）的益生菌,因其菌體成分和分泌物能夠明顯促進(jìn)黏膜和體液免疫,亦是疫苗佐劑候選者。本研究利用重組鞭毛蛋白的免疫增強(qiáng)作用,通過(guò)以傳染性法氏囊病毒（IBDV）為抗原模型,探討了鞭毛蛋白對(duì)不同形式疫苗的免疫增強(qiáng)作用,結(jié)合干酪乳桿菌外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)無(wú)毒素殘留、菌體及分泌成分具有益生作用的優(yōu)勢(shì),以期獲得純化步驟簡(jiǎn)單、易于生產(chǎn)的重組鞭毛蛋白作為疫苗免疫佐劑的候選者。利用PCR方法... 

【文章頁(yè)數(shù)】：105 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白的概況
        1.1.1 鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.2 鞭毛蛋白與天然免疫
        1.1.3 鞭毛蛋白與獲得性免疫
    1.2 沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白的佐劑作用
        1.2.1 鞭毛蛋白作為佐劑的研究進(jìn)展
        1.2.2 鞭毛蛋白作為雞疫苗佐劑的研究
    1.3 乳酸菌表達(dá)重組蛋白的優(yōu)勢(shì)
        1.3.1 乳酸菌作為疫苗佐劑的潛能
        1.3.2 乳酸菌作為活菌載體表達(dá)外源蛋白的研究
        1.3.3 禽為模型的乳酸菌相關(guān)研究
    1.4 IBDV疫苗的研究與應(yīng)用
    1.5 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒、細(xì)胞和抗體
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 質(zhì)粒和菌株
        2.1.4 酶類及主要試劑
        2.1.5 引物
        2.1.6 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 FIiB、FIiBc和IBDV VP2基因片段的克隆
        2.2.2 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2基因E.coli表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2在E.coli中表達(dá)和鑒定
        2.2.4 乳酸菌表達(dá)載體pPG-2-FliB、pPG-2-FliBc和pPG-2-FliBc-VP2的構(gòu)建
        2.2.5 目的蛋白在干酪乳桿菌L.393中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
        2.2.6 乳酸菌表達(dá)的重組蛋白體外活性檢測(cè)
        2.2.7 FliBc、VP2和FliBc-VP2重組蛋白的純化和免疫
        2.2.8 pPG-2-FliB/L.casei393和pPG-2-FliBc/L.casei393培養(yǎng)上清的處理并和IBDV弱毒疫苗配合的免疫
        2.2.9 乳酸菌活載體疫苗的制備和免疫
        2.2.10 疫苗免疫效果的評(píng)估
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 IBDV-VP2、FliB和FliBc基因的克隆
        3.1.1 FliB和FliBc基因的克隆
        3.1.2 IBDV-VP2基因的克隆
    3.2 FliBc、VP2和FliBc-VP2基因E.coli表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.1 Ppro-HTa-FliB和Ppro-HTa-FliBc的構(gòu)建
        3.2.2 重組載體Ppro-HTa-VP2的構(gòu)建
        3.2.3 重組載體Ppro-HTa-FliBc-VP2的構(gòu)建
    3.3 重組E.coli的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定
        3.3.1 鞭毛蛋白Fli的多克隆抗體的制備
        3.3.2 E.coli表達(dá)重組蛋白FliB和FliBc的表達(dá)鑒定
        3.3.3 Ppro-HTa-VP2/BL21的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定
        3.3.4 Ppro-HTa-FliC-VP2/BL21的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定
    3.4 重組乳酸菌載體的構(gòu)建與鑒定
        3.4.1 重組載體pPG-2-FliB的構(gòu)建及鑒定
        3.4.2 重組載體pPG-2-FliBc的構(gòu)建及鑒定
        3.4.3 重組載體pPG-2-FliB-VP2的構(gòu)建及鑒定
    3.5 FliB、FliBc和FliBc-VP2基因的乳酸菌表達(dá)及鑒定
        3.5.1 pPG-2-FliB/L.casei393、pPG-2-FliBc/L.casei393的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.5.2 pPG-2-FliBc-VP2/L.casei393的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.6 乳酸菌表達(dá)的重組蛋白FliB和FliBc體外活性檢測(cè)
        3.6.1 重組乳酸菌表達(dá)蛋白的處理和檢測(cè)
        3.6.2 對(duì)Caco-2細(xì)胞表達(dá)TLR-5和IL-8水平的影響
    3.7 FliBc對(duì)VP2亞單位疫苗佐劑活性的評(píng)估
        3.7.1 亞單位疫苗重組疫苗的純化
        3.7.2 免疫SPF雞血清中特異性IgY的測(cè)定
        3.7.3 特異性脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
        3.7.4 血清中和抗體效價(jià)
        3.7.5 攻毒保護(hù)性試驗(yàn)
    3.8 FliBc對(duì)IBDV弱毒疫苗佐劑活性的評(píng)估
        3.8.1 免疫SPF雞血清中特異性IgY的測(cè)定
        3.8.2 特異性脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
        3.8.3 中和抗體水平
        3.8.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)
    3.9 FliBc對(duì)IBDV活載體疫苗佐劑活性的評(píng)估
        3.9.1 pPG2-VP2/L.casei393和pPG2-FliBc-VP2/L.casei393免疫SPF雞血清特異性IgY的測(cè)定
        3.9.2 特異性脾淋巴細(xì)胞增殖活性
        3.9.3 液、氣管灌洗液和腸粘液中分泌型IgA的測(cè)定
        3.9.4 中和抗體水平檢測(cè)
        3.9.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)
4 討論
    4.1 重組目的蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化選擇
    4.2 鞭毛蛋白佐劑活性區(qū)域的選擇
    4.3 IBDV作為抗原模型的選擇
    4.4 鞭毛蛋白作為免疫佐劑對(duì)亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)效應(yīng)
    4.5 鞭毛蛋白對(duì)弱毒疫苗的免疫增強(qiáng)作用
    4.6 鞭毛蛋白作為乳酸菌疫苗的分子佐劑的免疫增強(qiáng)作用
    4.7 鞭毛蛋白應(yīng)用的潛在價(jià)值
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)菌鞭毛的致病性及其免疫學(xué)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 郭志燕,周明旭,段強(qiáng)德,朱國(guó)強(qiáng).  微生物學(xué)報(bào). 2014(03)
[2]近期引起免疫失敗的傳染性腔上囊病病毒VP2基因的分子特征[J]. 王永山,歐陽(yáng)偉,潘群興,范紅結(jié),張海彬,王忠燦,唐雨德,譚維國(guó).  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2008(12)
[3]傳染性法氏囊病病毒檢測(cè)系統(tǒng)的建立[J]. 王忠燦,王永山,唐雨德,譚維國(guó),施正良,歐陽(yáng)偉.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(09)
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本文編號(hào)：3721930