葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,Gox）作為一種新型飼用酶制劑,在畜禽生產上通過改善腸道環(huán)境、預防腸道感染和腹瀉,從而提高飼糧消化利用率,促進其生長。優(yōu)良的飼用Gox應具有良好的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。本研究以實驗室前期獲得的Gox酶突變體GoxM4為研究材料,利用計算機輔助設計進行分子改良研究,獲得熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性顯著提高的突變體,并探究Gox的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性機理。采用計算機輔助的理性設計對GoxM4繼續(xù)進行熱穩(wěn)定性改良研究。通過糖基化修飾、輔基FAD結合能優(yōu)化、疏水作用力引入和折疊自由能優(yōu)化等四種策略進行迭代突變,獲得了累積5個氨基酸突變位點的突變體GoxM8（T31V/Q88R/S94A/T274F/Y278T）。GoxM8的熱穩(wěn)定性顯著提高,在80°C下處理2 min后的剩余酶活由GoxM4的40%提高到了80%。基于酶恒定剩余酶活Amin與溫度之間的負相關性計算其Tm值,GoxM8較GoxM4提高了9.5○C。Gox M8的催化效率（kcat/Km值）較GoxM4提高了6.8%,分別為28.3 mM-1s-1和26.5 m M-1s-1。利用分子動力學模擬技術... 

【文章頁數】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號對照表
第一章 緒論
    1.1 葡萄糖氧化酶概述
        1.1.1 葡萄糖氧化酶的來源
        1.1.2 葡萄糖氧化酶的基本性質
        1.1.3 葡萄糖氧化酶的結構特點及催化機理
        1.1.4 葡萄糖氧化酶的生產
        1.1.5 葡萄糖氧化酶的活性測定
        1.1.6 葡萄糖氧化酶的應用前景
    1.2 葡萄糖氧化酶的分子改良研究進展
    1.3 蛋白質穩(wěn)定性及其分子改良
        1.3.1 非理性設計策略
        1.3.2 理性設計策略
    1.4 研究內容與目的
第二章 葡萄糖氧化酶GoxM4的熱穩(wěn)定性改良研究
    2.1 實驗材料和儀器
        2.1.1 菌株和質粒
        2.1.2 引物合成和測序
        2.1.3 生化試劑、試劑盒和工具酶
        2.1.4 實驗培養(yǎng)基及試劑配制
        2.1.5 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 定點突變實驗
        2.2.2 Gox各突變體的異源表達
        2.2.3 GoxM4及其突變體酶學性質測定
        2.2.4 GoxM4及其突變體的分子動力學模擬
    2.3 實驗結果
        2.3.1 高通量平板篩選方法的建立
        2.3.2 GoxM4突變位點的設計
        2.3.3 GoxM4各突變體的篩選結果
        2.3.4 GoxM4及其突變體在搖床水平的表達和純化
        2.3.5 GoxM4及其突變體的熱穩(wěn)定參數的評估
        2.3.6 GoxM4及其突變體的分子動力學模擬
    2.4 討論
    本章小結
第三章 葡萄糖氧化酶GoxM8的酸穩(wěn)定性改良研究
    3.1 實驗材料和儀器
        3.1.1 菌株和質粒
        3.1.2 引物合成和測序
        3.1.3 生化試劑、試劑盒和工具酶
        3.1.4 實驗培養(yǎng)基及試劑配制
        3.1.5 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 模擬GoxM8 在胃腸道環(huán)境中的p H穩(wěn)定性和活性
        3.2.2 GoxM8及其突變體的定點突變實驗
        3.2.3 GoxM8及其突變體的異源表達
        3.2.4 GoxM8及各突變體酶學性質測定
    3.3 實驗結果
        3.3.1 GoxM8 在胃腸道環(huán)境中的pH穩(wěn)定性和活性的模擬結果
        3.3.2 GoxM8突變體的設計結果
        3.3.3 GoxM8突變體篩選結果
        3.3.4 GoxM8突變體搖床水平的表達和純化結果
        3.3.5 GoxM8突變體的酶學性質鑒定
        3.3.6 GoxM8 突變體的pKa的計算結果
        3.3.7 GoxM8突變體的結構分析
    3.4 討論
    本章小結
第四章 全文總結
參考文獻
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
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