豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。該病于1987年首先在美國爆發(fā)，而后在全球范圍內(nèi)迅速蔓延開來，該病毒于1996年首次在中國大陸分離到，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。 PRRSV感染宿主細胞首先通過與細胞膜表面上的特異性受體結(jié)合，利用細胞的內(nèi)吞作用而感染細胞。至今，已經(jīng)報道的與PRRSV感染相關(guān)的細胞受體有唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）、硫酸乙酰肝素（Heparin sulphate，HS）、波形蛋白（Vimentin）、清道夫受體（CD163）。本實驗室利用針對PRRSV GP5蛋白的單克隆抗獨特型抗體（Mab2-5G2），在PRRSV易感細胞上發(fā)現(xiàn)并證明了非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（Non-musclemyosin heavy chainⅡA，NMHC-ⅡA）為PRRSV的細胞受體蛋白。 一個完整的細胞周期是指細胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成的過程。在這一完整的... 

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 細胞周期
    1.2 細胞周期調(diào)控
        1.2.1 細胞周期檢測點
        1.2.2 細胞周期的調(diào)控蛋白
        1.2.3 細胞周期調(diào)控蛋白的降解
    1.3 細胞周期同步化
    1.4 豬繁殖與呼吸綜合征概述
    1.5 PRRSV 生物學特征
    1.6 PRRSV 基因組結(jié)構(gòu)
        1.6.1 非結(jié)構(gòu)蛋白
        1.6.2 結(jié)構(gòu)蛋白
    1.7 PRRSV 免疫學研究進展
        1.7.1 體液免疫
        1.7.2 細胞免疫
    1.8 PRRSV 受體的研究進展
        1.8.1 硫酸乙酰肝素
        1.8.2 唾液酸粘附素
        1.8.3 CD163
        1.8.4 波形蛋白
        1.8.5 非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重鏈 A
    1.9 病毒感染與細胞周期
        1.9.1 病毒感染對細胞 G_1/S 檢查點的調(diào)控
        1.9.2 病毒感染對細胞 G_2/M 期休眠的調(diào)控
    1.10 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞、毒株與抗體
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 主要試劑與藥品
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 主要設(shè)備及儀器
    2.2 方法
        2.2.1 Marc-145 細胞的傳代培養(yǎng)及 PRRSV 增殖
            2.2.1.1 Marc-145 細胞的培養(yǎng)及傳代
            2.2.1.2 PRRSV 的增殖與病毒滴度測定
        2.2.2 單克隆抗獨特型抗體 5G2 與 6D10 的制備與純化
            2.2.2.1 腹水的制備
            2.2.2.2 單克隆抗體的純化
        2.2.3 Marc-145 細胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.1 Marc-145 細胞 G_0/G_1期細胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.2 Marc-145 細胞 S 期細胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.3 Marc-145 細胞 G_2/M 期細胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.4 藥物 Nocodazole 對 Marc-145 細胞分裂的影響
            2.2.3.5 流式細胞儀檢測 Marc-145 細胞周期同步化效果
        2.2.4 統(tǒng)計學處理
        2.2.5 PRRSV 在 Marc-145 細胞不同周期內(nèi)的易感性測定
            2.2.5.1 實時熒光定量（Real time PCR）測定
            2.2.5.2 間接免疫熒光（IFA）測定
            2.2.5.3 蛋白免疫印跡（Western blot）測定
            2.2.5.4 病毒上清 TCID_50測定
        2.2.6 Marc-145 細胞不同周期內(nèi) PRRSV 細胞受體表達量測定
            2.2.6.1 實時熒光定量（Real time PCR）測定細胞受體表達量
            2.2.6.2 蛋白免疫印跡（Western blot）測定細胞受體表達量
3 結(jié)果與分析
    3.1 單克隆抗獨特型抗體 5G2 以及抗 PRRSV N 蛋白單克隆抗體 6D10 的制備與純化
    3.2 Marc-145 細胞周期同步化方法的建立
        3.2.1 Marc-145 細胞 G_0/G_1期細胞周期同步化方法的建立
        3.2.2 Marc-145 細胞 S 期細胞周期同步化方法的建立
        3.2.3 Marc-145 細胞 G_2/M 期細胞周期同步化方法的建立
        3.2.4 藥物 Nocodazole 對 Marc-145 細胞分裂的影響
    3.3 PRRSV 在 Marc-145 細胞不同周期內(nèi)的易感性測定
        3.3.1 實時熒光定量（Real time PCR）測定 PRRSV 在 Marc-145 細胞不同周期內(nèi)的吸附性差異
        3.3.2 間接免疫熒光（IFA）測定 PRRSV 在 Marc-145 細胞不同周期內(nèi)的感染差異
        3.3.3 Western blot 測定 PRRSV 在 Marc-145 細胞不同周期內(nèi)的感染差異
        3.3.4 TCID_50測定 PRRSV 感染不同周期 Marc-145 細胞后上清病毒含量的差異
    3.4 Marc-145 細胞不同周期內(nèi) PRRSV 細胞受體表達水平的檢測
        3.4.1 Marc-145 細胞不同周期內(nèi) PRRSV 細胞受體基因水平的檢測
        3.4.2 Marc-145 細胞不同周期內(nèi) PRRSV 細胞受體蛋白水平的檢測
4 討論
    4.1 Marc-145 細胞周期同步化方法的建立
    4.2 Marc-145 細胞不同周期對 PRRSV 感染細胞的影響
    4.3 Marc-145 細胞不同周期 PRRSV 細胞受體表達水平的差異
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3715544