目的基因,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-VP3,并在大腸桿菌BL-21（DE3）中獲得表達(dá),對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和’Western-blot鑒定,將純化后的融合蛋白免疫健康家兔,制備兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗體,通過間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果表明,本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30a-VP3,分子質(zhì)量大小約為60Ku,具有良好的反應(yīng)原性；成功制備了兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗體,抗體效價(jià)為1：200。 2、GPV-VP3基因重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定。 為了構(gòu)建GPV-VP3基因重組腺病毒載體,本試驗(yàn)利用PCR擴(kuò)增得到《GPV-VP3基因,采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了High-VP3轉(zhuǎn)移載體,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式將該重組質(zhì)粒與腺病毒Ad5共轉(zhuǎn)染QBI-HEK293細(xì)胞,待細(xì)胞出現(xiàn)病變（CPE）后,采用反復(fù)凍融的方式收獲重組病毒,進(jìn)行重組病毒VP3基因的PCR鑒定,并利用間接免疫熒光（IFA）試驗(yàn)及Western blot試驗(yàn)對(duì)重組病毒進(jìn)行檢測(cè),分析重組病毒VP3基因的抗病毒活性。結(jié)果顯示,成功制備了表達(dá)GPV-VP3基因的重組腺病毒（rAd-VP3）,其病毒... 

【文章頁數(shù)】：37 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
材料與方法
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 載體及主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 試驗(yàn)所需溶液及其配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 設(shè)計(jì)與合成引物
        2.2 PCR擴(kuò)增鵝VP3基因
        2.3 VP3基因純化回收
        2.4 VP3基因的TA克隆
        2.5 轉(zhuǎn)化
        2.6 提取克隆質(zhì)粒
        2.7 克隆質(zhì)粒的鑒定
        2.8 構(gòu)建并鑒定pET-30a-VP3表達(dá)質(zhì)粒
        2.9 表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)及表達(dá)形式鑒定
        2.10 重組蛋白純化
        2.11 多克隆抗體制備
        2.12 多克隆抗體的鑒定
        2.13 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)
        2.14 QBI-HEK-293細(xì)胞的復(fù)蘇
        2.15 Ad5擴(kuò)大培養(yǎng)
        2.16 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.17 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-VP3的構(gòu)建
        2.18 重組腺病毒質(zhì)粒High-VP3的構(gòu)建
        2.19 重組腺病毒rAd-VP3的制備
        2.20 rAd-VP3的Rt-PCR鑒定
        2.21 IFAT檢測(cè)VP3基因在rAd-VP3中的表達(dá)
        2.22 Western-blot分析
        2.23 重組腺病毒rAd-VP3 TCID_(50)的測(cè)定
結(jié)果
    3.1 鵝細(xì)小病毒VP3基因的PCR擴(kuò)增及克隆質(zhì)粒的鑒定
    3.2 鑒定表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-VP3
    3.3 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)
    3.4 重組蛋白存在形式鑒定
    3.5 重組蛋白純化
    3.6 重組蛋白Western-blot分析
    3.7 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定
    3.8 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-VP3的鑒定
    3.9 重組腺病毒質(zhì)粒High-VP3的鑒定
    3.10 重組腺病毒rAd-VP3的制備
    3.11 rAd-VP3的Rt-PCR鑒定
    3.12 IFAT檢測(cè)VP3基因在rAd-VP3中的表達(dá)
    3.13 Western-blot分析
    3.14 重組腺病毒rAd-VP3病毒滴度測(cè)定
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]鵝細(xì)小病毒病油乳劑滅活疫苗的研制[D]. 李琳.吉林大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3708035