目的:氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）是最具致病性的梭菌之一,主要引起氣腫疽,也稱為黑腿病,該病具有高致死率,在全球范圍內(nèi)造成畜牧業(yè)生產(chǎn)的重大損失。氣腫疽梭菌細胞毒素（CctA）是其產(chǎn)生的五種毒素中最典型的致病性毒素,具有細胞毒性和溶血活性,是主要的保護性抗原,在致病性中起著主導(dǎo)作用,成為黑腿病疫苗的一個有價值的候選抗原。本試驗通過對氣腫疽梭菌CctA全長基因進行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建截短CctA基因原核表達質(zhì)粒并誘導(dǎo)蛋白表達,制備亞單位疫苗免疫豚鼠,建立間接ELISA方法檢測豚鼠體內(nèi)抗體水平,對亞單位疫苗的免疫效果進行初步分析。方法:1.根據(jù)公布的CctA基因序列設(shè)計特異性引物并合成。利用生物信息學(xué)分析軟件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,對CctA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、糖基化位點、優(yōu)勢抗原表位等進行預(yù)測。2.根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,合成CctA全長基因去除信號肽及部分序列的片段。將截短CctA基因經(jīng)pMD19-T克隆后插入原核表達載體pET-28a（+）,轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細胞,利用... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表
第一章 緒論 氣腫疽梭菌研究進展
    1 病原學(xué)
    2 流行病學(xué)
        2.1 傳染源
        2.2 傳播途徑
        2.3 易感動物
        2.4 流行現(xiàn)狀
    3 主要毒力因子
        3.1 細胞毒素
        3.2 鞭毛蛋白
        3.3 透明質(zhì)酸酶
        3.4 神經(jīng)氨酸酶
        3.5 DNAse
    4 臨床癥狀及病理變化
    5 診斷方法
    6 疫苗研究進展
    7 小結(jié)
第二章 試驗內(nèi)容
    試驗一 CctA全長基因的擴增及生物信息學(xué)分析
        1 材料
            1.1 試驗材料及試劑
            1.2 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 引物的設(shè)計與合成
            2.2 CctA全長基因的擴增
            2.3 CctA蛋白的相關(guān)生物信息學(xué)分析
        3 結(jié)果與分析
            3.1 氣腫疽梭菌CctA全長基因PCR擴增結(jié)果
            3.2 CctA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測
                3.2.1 CctA蛋白的理化性質(zhì)分析
                3.2.2 CctA蛋白氨基酸序列的親疏水性分析
                3.2.3 CctA蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測
                3.2.4 CctA蛋白糖基化及磷酸化位點的預(yù)測
                3.2.5 CctA蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
                3.2.6 CctA蛋白潛在抗原表位的預(yù)測
        4 討論
    試驗二 截短CctA基因在大腸桿菌中的表達與純化
        1 材料
            1.1 試驗菌株及載體
            1.2 主要試劑
            1.3 主要培養(yǎng)基及試劑的配制
            1.4 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 截短CctA基因的擴增
            2.2 重組pMD19-T-CctA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
                2.2.1 PCR產(chǎn)物的純化
                2.2.2 目的基因與pMD19-T載體連接
                2.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                2.2.4 重組克隆質(zhì)粒的提取
                2.2.5 重組克隆質(zhì)粒的鑒定
            2.3 重組pET-28a(+)-CctA表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
                2.3.1 重組克隆質(zhì)粒與表達載體pET-28a(+)的雙酶切與回收
                2.3.2 目的片段與表達質(zhì)粒pET-28a(+)的連接
                2.3.3 重組表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
                2.3.4 重組表達質(zhì)粒的鑒定
            2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及擴大培養(yǎng)
            2.5 重組蛋白的純化
            2.6 重組蛋白Western blot反應(yīng)原性檢測
            2.7 包涵體蛋白的復(fù)性
        3 結(jié)果與分析
            3.1 截短CctA基因擴增結(jié)果
            3.2 CctA基因重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定
            3.3 CctA基因重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定
            3.4 重組表達菌的誘導(dǎo)表達
            3.5 重組蛋白大量誘導(dǎo)結(jié)果
            3.6 重組蛋白的純化
            3.7 重組蛋白的Western blot分析
            3.8 包涵體蛋白復(fù)性結(jié)果
        4 討論
    試驗三 重組CctA免疫原性初步研究
        1 材料
            1.1 菌種、佐劑及主要實驗試劑
            1.2 主要試劑與培養(yǎng)基配制
            1.3 試驗動物
            1.4 主要耗材及儀器
        2 方法
            2.1 重組蛋白的滅活檢驗及疫苗配制
            2.2 動物免疫試驗
            2.3 攻毒保護試驗
                2.3.1 攻毒用強毒的制備
                2.3.2 攻毒用強毒菌液的毒力測定
                2.3.3 攻毒試驗
            2.4 間接ELISA檢測方法的建立
                2.4.1 ELISA反應(yīng)條件的篩選
                2.4.2 最佳反應(yīng)條件的確定
                2.4.3 陰陽性判定標準確定
            2.5 間接ELISA方法檢測抗體水平
        3 結(jié)果與分析
            3.1 滅活檢驗結(jié)果
            3.2 攻毒用強毒的毒力測定結(jié)果
            3.3 攻毒試驗結(jié)果
            3.4 間接ELISA檢測方法的建立
                3.4.1 ELISA檢測方法最佳條件的確定
                3.4.2 陰陽性判定標準確定
            3.5 間接ELISA檢測抗體水平結(jié)果
        4 討論
全文總結(jié)
參考文獻
附錄
致謝
簡介
導(dǎo)師評閱表


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]氣腫疽梭菌CctA基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定[J]. 張皓,段雪巖,張永佳,車達,鄧文學(xué),李成輝,關(guān)如婷,金鑫.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2018(05)
[4]氣腫疽梭菌檢測方法概述[J]. 張皓,任春宇,車達,張永佳,李成輝,金鑫.  動物醫(yī)學(xué)進展. 2017(09)
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[6]家畜氣腫疽的研究進展[J]. 陳發(fā)喜,蔡擴軍,范玉娟,何克明,王清平.  草食家畜. 2015(03)
[7]牛氣腫疽病的診治技術(shù)探討[J]. 莫奉乙,楊恩忠,羅應(yīng)華,董書恒,趙克華,和平.  畜禽業(yè). 2015(02)
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碩士論文
[1]延邊株氣腫疽梭菌的分離鑒定及cctA基因的克隆和表達[D]. 云巾宴.延邊大學(xué) 2015
[2]牛氣腫疽CctA基因核酸疫苗的制備及免疫效果評價[D]. 齊強.延邊大學(xué) 2017



本文編號：3706916