雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis, IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的一種高度接觸性、急性呼吸道傳染病。目前該病在全世界傳播流行廣泛,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。由于該病毒頻繁出現(xiàn)基因的突變和重組現(xiàn)象,導(dǎo)致很多不同基因型和血清型毒株的出現(xiàn),而且這些毒株間的交叉保護性較低,甚至不存在交叉保護性,因此分析IBV基因組的結(jié)構(gòu)特點有助于對傳染性支氣管炎進行防控。 本研究以IBV SC021202株作為參考毒株設(shè)計了20對引物,利用RT-PCR法對IBVHH06株的內(nèi)部基因組序列進行分段擴增,同時利用RACE Kit試劑盒對基因組的非編碼區(qū)5’UTR和3’UTR進行擴增,對擴增得到的所有片段進行克隆及序列測定。將測序結(jié)果進行拼接,并且利用DNAStar軟件和MEGA5.0軟件對其全進組及各個基因序列進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示IBV HH06株全基因組由27663個核苷酸組成,具有典型IBV基因序列特征。對不同毒株的全基因組及各個基因的序列大小進行比較,發(fā)現(xiàn)各毒株間3a、3b、5a、5b和N基... 

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 IBV的病原生物學(xué)研究
        1.1.1 傳染性支氣管炎病毒的分類
        1.1.2 傳染性支氣管炎病毒的形態(tài)
        1.1.3 傳染性支氣管炎病毒的理化及生物特性
        1.1.4 傳染性性支氣管炎病毒國內(nèi)外流行情況
    1.2 IBV的基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.1 傳染性支氣管炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白生物學(xué)功能
        1.2.2 傳染性支氣管炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白生物學(xué)功能
        1.2.3 傳染性支氣管炎病毒非編碼區(qū)生物學(xué)功能
        1.2.4 IBV的全基因組序列研究進展
    1.3 IB的病理變化
        1.3.1 傳染性支氣管炎病毒的致病性
        1.3.2 傳染性支氣管炎病毒的臨床癥狀及病理變化
    1.4 IB的診斷和防治
        1.4.1 傳染性支氣管炎的診斷
        1.4.2 傳染性支氣管炎的防治
    1.5 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物及SPF雞胚
        2.1.2 毒株、菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 試驗試劑
        2.1.4 試驗試劑及培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 病毒的增殖培養(yǎng)
        2.2.2 病毒總RNA的提取
        2.2.3 HH06株IBV全基因組內(nèi)部片段的RT-PCR分段擴增
        2.2.4 RACE法獲取5’末端和3’末端非編碼區(qū)片段
        2.2.5 目的基因的克隆及序列測定
        2.2.6 IBV全基因組序列的生物信息學(xué)分析
        2.2.7 IBV M部分基因的亞克隆及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.8 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定
        2.2.9 重組M1蛋白的多克隆抗體的制備
        2.2.10 M1蛋白多克隆抗體的生物學(xué)功能檢測
        2.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
3 結(jié)果與分析
    3.1 全基因組RT-PCR分段擴增結(jié)果
    3.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        3.2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
    3.3 序列測定及拼接
    3.4 全基因組序列的生物信息學(xué)分析
        3.4.1 基因組結(jié)構(gòu)分析
        3.4.2 序列同源性分析
        3.4.3 系統(tǒng)進化樹分析
        3.4.4 IBV S基因裂解位點分析比較
        3.4.5 重組分析
        3.4.6 壓力選折分析
    3.5 重組表達質(zhì)粒PET30A-M1和PVAX-M1的構(gòu)建
    3.6 PET-M1蛋白的表達及WESTERN BLOT分析
    3.7 M1蛋白多克隆抗體制備及其鑒定
        3.7.1 M1蛋白多克隆抗體效價檢測和Western blot分析
        3.7.2 M1蛋白多克隆抗體IFA檢測
        3.7.3 病毒感染抑制實驗
4 討論
    4.1 全基因組分段擴增
    4.2 生物信息學(xué)分析
    4.3 M蛋白表達分析
    4.4 M蛋白生物學(xué)功能分析
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3706412