發(fā)布時(shí)間：2022-11-12 12:58

　　雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis, IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的一種高度接觸性、急性呼吸道傳染病。目前該病在全世界傳播流行廣泛,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病毒頻繁出現(xiàn)基因的突變和重組現(xiàn)象,導(dǎo)致很多不同基因型和血清型毒株的出現(xiàn),而且這些毒株間的交叉保護(hù)性較低,甚至不存在交叉保護(hù)性,因此分析IBV基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有助于對(duì)傳染性支氣管炎進(jìn)行防控。 本研究以IBV SC021202株作為參考毒株設(shè)計(jì)了20對(duì)引物,利用RT-PCR法對(duì)IBVHH06株的內(nèi)部基因組序列進(jìn)行分段擴(kuò)增,同時(shí)利用RACE Kit試劑盒對(duì)基因組的非編碼區(qū)5’UTR和3’UTR進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增得到的所有片段進(jìn)行克隆及序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,并且利用DNAStar軟件和MEGA5.0軟件對(duì)其全進(jìn)組及各個(gè)基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示IBV HH06株全基因組由27663個(gè)核苷酸組成,具有典型IBV基因序列特征。對(duì)不同毒株的全基因組及各個(gè)基因的序列大小進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)各毒株間3a、3b、5a、5b和N基... 

【文章頁(yè)數(shù)】：85 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 IBV的病原生物學(xué)研究
        1.1.1 傳染性支氣管炎病毒的分類(lèi)
        1.1.2 傳染性支氣管炎病毒的形態(tài)
        1.1.3 傳染性支氣管炎病毒的理化及生物特性
        1.1.4 傳染性性支氣管炎病毒國(guó)內(nèi)外流行情況
    1.2 IBV的基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.1 傳染性支氣管炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白生物學(xué)功能
        1.2.2 傳染性支氣管炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白生物學(xué)功能
        1.2.3 傳染性支氣管炎病毒非編碼區(qū)生物學(xué)功能
        1.2.4 IBV的全基因組序列研究進(jìn)展
    1.3 IB的病理變化
        1.3.1 傳染性支氣管炎病毒的致病性
        1.3.2 傳染性支氣管炎病毒的臨床癥狀及病理變化
    1.4 IB的診斷和防治
        1.4.1 傳染性支氣管炎的診斷
        1.4.2 傳染性支氣管炎的防治
    1.5 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及SPF雞胚
        2.1.2 毒株、菌株及質(zhì)粒
        2.1.3 試驗(yàn)試劑
        2.1.4 試驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 病毒的增殖培養(yǎng)
        2.2.2 病毒總RNA的提取
        2.2.3 HH06株IBV全基因組內(nèi)部片段的RT-PCR分段擴(kuò)增
        2.2.4 RACE法獲取5’末端和3’末端非編碼區(qū)片段
        2.2.5 目的基因的克隆及序列測(cè)定
        2.2.6 IBV全基因組序列的生物信息學(xué)分析
        2.2.7 IBV M部分基因的亞克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.8 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
        2.2.9 重組M1蛋白的多克隆抗體的制備
        2.2.10 M1蛋白多克隆抗體的生物學(xué)功能檢測(cè)
        2.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
3 結(jié)果與分析
    3.1 全基因組RT-PCR分段擴(kuò)增結(jié)果
    3.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        3.2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
    3.3 序列測(cè)定及拼接
    3.4 全基因組序列的生物信息學(xué)分析
        3.4.1 基因組結(jié)構(gòu)分析
        3.4.2 序列同源性分析
        3.4.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
        3.4.4 IBV S基因裂解位點(diǎn)分析比較
        3.4.5 重組分析
        3.4.6 壓力選折分析
    3.5 重組表達(dá)質(zhì)粒PET30A-M1和PVAX-M1的構(gòu)建
    3.6 PET-M1蛋白的表達(dá)及WESTERN BLOT分析
    3.7 M1蛋白多克隆抗體制備及其鑒定
        3.7.1 M1蛋白多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)和Western blot分析
        3.7.2 M1蛋白多克隆抗體IFA檢測(cè)
        3.7.3 病毒感染抑制實(shí)驗(yàn)
4 討論
    4.1 全基因組分段擴(kuò)增
    4.2 生物信息學(xué)分析
    4.3 M蛋白表達(dá)分析
    4.4 M蛋白生物學(xué)功能分析
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3706412