發(fā)布時(shí)間：2022-11-09 20:15

　　為了闡明奶牛SCAP/SREBP1在肝臟細(xì)胞中調(diào)控脂肪酸合成酶基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制,試驗(yàn)以荷斯坦奶牛肝臟組織c DNA為模板,克隆SCAP基因的編碼序列,構(gòu)建pc DNA3.1-SCAP表達(dá)載體;利用PCR從奶牛基因組DNA中克隆構(gòu)建3個(gè)不同片段長度的FASN熒光素酶報(bào)告基因載體;采用免疫熒光的方法對SCAP以及SREBP1標(biāo)記,激光共聚焦觀察SCAP及SREBP1蛋白的亞細(xì)胞定位;并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測SCAP基因m RNA的表達(dá);用Western blotting法檢測SCAP和核SREBP1蛋白表達(dá);將FASN基因啟動(dòng)子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝臟細(xì)胞,并分別轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-SREBP1質(zhì)粒、pc DNA3.1-SCAP質(zhì)粒以及共轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-SREBP1和pc DNA3.1-SCAP質(zhì)粒作為處理,雙熒光素酶檢測FASN啟動(dòng)子的活性影響;后期又將FASN基因啟動(dòng)子質(zhì)粒和pc DNA3.1-SREBP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝臟細(xì)胞,并分別轉(zhuǎn)染不同劑量的pc DNA3.1-SCAP質(zhì)粒作為處理,雙熒光素酶檢測FASN啟動(dòng)子的活性影響;在肝臟細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-SREBP1... 

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 SCAP/SREBP脂類合成信號通路
        1.1.1 SREBP結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.2 SCAP結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.3 SCAP介導(dǎo)的SREBPs活化過程
    1.2 脂類合成關(guān)鍵基因(FASN)的研究進(jìn)展
        1.2.1 脂肪酸合成機(jī)理及調(diào)控
        1.2.2 脂肪酸合成酶(FASN)的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.3 FASN在SREBP信號通路中的研究與意義
    1.3 脂類代謝疾病研究進(jìn)展
2 引言
3 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞
        3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
        3.1.3 試劑
        3.1.4 儀器
    3.2 方法
        3.2.1 pcDNA3.1-SCAP真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        3.2.3 免疫熒光
        3.2.4 FASN基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建
        3.2.5 熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)FASN啟動(dòng)子活性的檢測
        3.2.6 蛋白免疫印跡
        3.2.7 尼羅紅染色
        3.2.8 數(shù)據(jù)分析
4 結(jié)果與分析
    4.1 SCAP基因克隆,載體構(gòu)建及基因表達(dá)
        4.1.1 SCAP基因的克隆
        4.1.2 pcDNA3.1-SCAP真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
        4.1.3 SCAP基因在肝臟細(xì)胞中mRNA表達(dá)情況
    4.2 SCAP及SREBP1蛋白表達(dá)及在肝臟細(xì)胞中的定位
        4.2.1 SCAP及核SREBP1蛋白表達(dá)情況
        4.2.2 SREBP1及SCAP在肝臟細(xì)胞中的共定位
    4.3 FASN基因啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
        4.3.1 FASN基因啟動(dòng)子的克隆
        4.3.2 PGL3-FASN報(bào)告基因載體的構(gòu)建及鑒定
        4.3.3 FASN基因啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
        4.3.4 不同的處理因素對FASN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
        4.3.5 SCAP依賴SREBP1對FASN啟動(dòng)子的劑量轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
    4.4 SCAP/SREBP1對SREBP1基因、FASN基因表達(dá)及脂滴合成的影響
        4.4.1 SREBP1依賴SCAP促進(jìn)SREBP1基因的表達(dá)
        4.4.2 SREBP1依賴SCAP促進(jìn)FASN基因的表達(dá)
        4.4.3 SCAP/SREBP1對脂質(zhì)合成的影響
5 討論與結(jié)論
    5.1 討論
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
英文摘要


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]中國荷斯坦奶牛FASN基因部分序列多態(tài)性分析[J]. 任衛(wèi)合,王麗萍,劉容秀,張麗.  中國草食動(dòng)物科學(xué). 2017(03)
[2]日糧碳水化合物水平對體內(nèi)脂肪酸合成酶調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 沙爽,韓蕊,車東升.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2017(01)
[3]奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá)定位及對SCD1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J]. 韓立強(qiáng),王月影,王林楓,朱河水,鐘凱,褚貝貝,楊國宇.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2016(24)
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[5]FASN基因與反芻動(dòng)物脂肪形成的關(guān)系[J]. 吳江鴻,胡斯樂,祁云霞,何小龍,王曉光,劉永志,孫海蓮,王峰.  畜牧與獸醫(yī). 2013(07)
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[8]動(dòng)物脂肪酸合成酶基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 張力莉,徐曉鋒.  畜牧與獸醫(yī). 2012(04)
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博士論文
[1]Insig-1/SCAP/SREBP-1c通路對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響[D]. 房殿亮.重慶醫(yī)科大學(xué) 2013

碩士論文
[1]腺病毒介導(dǎo)的SREBP-1c過表達(dá)對奶牛肝細(xì)胞脂肪沉積的影響[D]. 楊文濤.吉林大學(xué) 2013
[2]西農(nóng)薩能羊脂肪酸合酶（FASN）基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和功能研究[D]. 李君.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2011
[3]西農(nóng)薩能羊乳腺脂肪酸合酶（FAS）基因及其啟動(dòng)子的克隆、測序與分析[D]. 王海濱.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2007



本文編號：3704822