口蹄疫是引起偶蹄動物的一種急性、熱性、接觸性傳染病。防控FMD主要技術(shù)手段是疫苗免疫,由于FMDV自然屬性限制,導致部分疫苗毒株生產(chǎn)性能不高,免疫效力低下。為解決疫苗生產(chǎn)中生產(chǎn)滴度較低、病變時間不穩(wěn)定的問題,本實驗室利用反向遺傳技術(shù)獲得了嵌合毒株rA-WT （Zheng, Guo et al.2013）。該嵌合毒株解決了這一難題,提高了疫苗生產(chǎn)滴度、產(chǎn)量和免疫效力。但該毒株生產(chǎn)種毒為強毒,存在生物安全隱患。本研究是在rA-WT嵌合毒株L的SAP區(qū)域進行突變,消除或降低天然免疫抑制功能,致使其對豬和牛能夠迅速誘導免疫應答,而不能發(fā)病,提高其作為疫苗毒株的生物安全性。 在實驗室已有A型FMDV重組質(zhì)粒（命名為prA-WT）基礎上,利用口蹄疫病毒反向遺傳操作技術(shù),通過定點突變,構(gòu)建口蹄疫病毒SAP區(qū)域突變的A型口蹄疫病毒重組質(zhì)粒（命名為prA-mSAP）。將構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細胞能致細胞病變（CPE）。連續(xù)傳代后,經(jīng)RT-PCR、間接免疫熒光等試驗鑒定,結(jié)果證實,成功拯救了SAP突變的重組病毒（命名為rA-mSAP）。另外,比較測定了該重組毒與親本毒（rA-WT）對BHK21細... 

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 口蹄疫概述
    1.2 我國A型FMD流行及變異
    1.3 種毒篩選及疫苗研制
    1.4 FMD疫苗改善方法
    1.5 研究目的及意義
第二章 口蹄疫病毒A型SAP突變毒株構(gòu)建、鑒定及生物學特性檢測
    摘要
    2.1 試驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒和細胞系
        2.1.2 載體與主要試劑
        2.1.3 試驗所用溶液及其配制
        2.1.4 試驗器材
    2.2 試驗方法
        2.2.1 引物設計與合成
        2.2.2 L基因SAP區(qū)域突變
        2.2.3 含有SAP突變的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 重組病毒的拯救
        2.2.5 拯救病毒的鑒定
        2.2.6 生物學特性測定
    2.3 試驗結(jié)果
        2.3.1 重組質(zhì)粒PCD-OL的鑒定
        2.3.2 含有SAP突變質(zhì)粒的鑒定
        2.3.3 重組病毒的拯救
        2.3.4 拯救病毒的鑒定
        2.3.5 拯救病毒的生物學特性
    2.4 討論
第三章 RA-WT和RA-MSAP對豬致病性差異分析
    摘要
    3.1 試驗材料
        3.1.1 毒株和試驗動物
        3.1.2 試驗試劑
    3.2 試驗方法
        3.2.1 攻毒方案
        3.2.2 實時熒光定量PCR檢測血毒癥和鼻試子核酸含量
        3.2.3 血清抗體水平檢測
    3.3 試驗結(jié)果
        3.3.1 攻毒后體溫測定以及臨床癥狀記錄結(jié)果
        3.3.2 血毒癥和鼻試子核酸測定結(jié)果
        3.3.3 攻毒后抗體水平結(jié)果
    3.4 討論
第四章 RA-WT和RA-MSAP免疫應答差異分析
    摘要
    4.1 試驗材料
        4.1.1 毒株和佐劑
        4.1.2 抗體及試劑盒
    4.2 試驗方法
        4.2.1 抗原量的確定以及滅活疫苗制備
        4.2.2 A型口蹄疫陰性豬的篩選
        4.2.3 免疫方案
        4.2.4 免疫后淋巴細胞亞群分化測定
        4.2.5 攻毒試驗
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 RA-MSAP毒株與RA-WT毒株肌肉注射豬血清抗體水平檢測結(jié)果
        4.3.2 RA-MSAP滅活疫苗和RA-WT滅活疫苗免疫豬的血清抗體水平檢測結(jié)果
        4.3.3 RA-MSAP毒株與RA-WT毒株肌肉注射豬外周血淋巴細胞亞群分布
        4.3.4 RA-MSAP滅活疫苗和RA-WT滅活疫苗免疫豬外周血淋巴細胞亞群分布
        4.3.5 RA-MSAP毒株和RA-WT毒株肌肉注射后攻毒試驗結(jié)果
        4.3.6 RA-MSAP滅活疫苗和RA-WT滅活疫苗免疫后攻毒試驗結(jié)果
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]以AdMax載體系統(tǒng)構(gòu)建和制備腎癌相關抗原G250基因重組腺病毒表達載體[J]. 齊桓.  南方醫(yī)科大學學報. 2008(09)



本文編號：3703490