pPG612是一種乳酸菌和大腸桿菌穿梭表達載體,但因其拷貝數較低,而且需要添加誘導劑才能誘導蛋白表達,不方便在生產中進行應用,因此本實驗在pPG612表達載體的基礎上加以改造,預期得到一個可高水平表達外源蛋白、不需添加誘導物的組成型表面表達載體。 產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽及人類食物中毒的主要病原菌之一,該菌的致病因子是其所產生的外毒素。各型產氣莢膜梭菌均產生α毒素（C.perfringens alpha-toxin, CPA）,它是產氣莢膜梭菌最重要的致病毒素之一,利用構建的組成型乳酸菌表達載體對去毒后的α毒素進行表達,篩選高表達量的組成型乳酸菌表達載體系統(tǒng),為構建新型重組乳酸菌活菌疫苗防治該病提供物質基礎。 本實驗中,構建了一個無需誘導的可表面表達a毒素蛋白的干酪乳桿菌組成型表達載體。以pPG612載體質粒為基本框架,將其原有表達元件替換為HCE啟動子、PgsA anchor、 rrnBT1T2終止子,改造后載體命名為pPG-PPT,將α毒素基因片段插入到表達載體pPG-PPT中,... 

【文章頁數】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 乳酸菌作為載體疫苗的研究進展
        1.1.1 乳酸菌的應用
        1.1.2 乳酸菌的腸道黏附作用
        1.1.3 干酪乳桿菌
    1.2 組成型與誘導型表達載體的研究進展
    1.3 乳酸菌載體表達元件
        1.3.1 乳酸菌表達載體的構成
        1.3.2 本實驗中組成型表達盒的構成元件
    1.4 翻譯增強子的簡介及其在表達載體中的應用
        1.4.1 轉錄增強子
        1.4.2 翻譯增強子
    1.5 產氣莢膜梭菌α毒素的研究進展
    1.6 實時熒光定量PCR方法的應用
    1.7 流式細胞術在基因表達分析中的應用
    1.8 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質粒與菌種
        2.1.2 抗體制劑
        2.1.3 實驗動物
        2.1.4 引物
        2.1.5 主要生物學試劑
        2.1.6 培養(yǎng)基
        2.1.7 主要儀器與設備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 目的基因的獲得
        2.2.2 PgsA anchor多克隆抗體的制備
        2.2.3 重組干酪乳桿菌表達系統(tǒng)構建
        2.2.4 重組干酪乳桿菌PgsA anchor和α毒素融合表達蛋白鑒定
        2.2.5 重組干酪乳桿菌表達載體的優(yōu)化
        2.2.6 優(yōu)化后重組菌蛋白表達的鑒定及其與優(yōu)化前重組菌蛋白表達情況的比較分析
3 結果
    3.1 目的基因的克隆與序列測定
        3.1.1 目的基因的PCR擴增結果
        3.1.2 重組質粒的雙酶切鑒定結果
    3.2 PgsA anchor多克隆抗體的制備
        3.2.1 原核表達載體pET-32a-PgsA的構建
        3.2.2 PgsA anchor基因在大腸桿菌中表達產物的SDS-PAGE鑒定
        3.2.3 重組蛋白表達鑒定及純化
        3.2.4 間接ELISA檢測重組PgsA anchor抗血清效價
    3.3 重組干酪乳桿菌表達系統(tǒng)的構建
        3.3.1 重組干酪乳桿菌表達載體pPG-PPT與pPG-PPαT的構建圖譜
        3.3.2 表達α毒素的重組干酪乳桿菌的構建
    3.4 重組干酪乳桿菌PgsA anchor和α毒素融合表達蛋白的鑒定
        3.4.1 表達產物的SDS-PAGE鑒定
        3.4.2 表達產物的Western Blot鑒定
    3.5 重組干酪乳桿菌表達載體的優(yōu)化
        3.5.1 重組質粒pMD18-TS-T7g10、pMD18-TS-Ω的酶切鑒定
        3.5.2 重組菌pPG-T7g10-PPαT/TG1、pPG-Ω-PPαT/TG1的鑒定
        3.5.3 重組干酪乳桿菌pPG-T7g1 0-PPαT/L.casei 393、pPG-Ω-PPαT/L.casei 393
    3.6 優(yōu)化后重組菌蛋白表達的鑒定及其與優(yōu)化前重組菌蛋白表達情況的比較分析
        3.6.1 表達產物的Western Blot鑒定
        3.6.2 表達產物的間接ELISA鑒定
        3.6.3 重組菌中mRNA熒光定量PCR相對定量分析
        3.6.4 表達產物流式細胞術檢測
        3.6.5 表達產物的間接免疫熒光定位檢測
        3.6.6 表達產物的激光共聚焦定位檢測
4 討論
    4.1 PgsA anchor與α毒素蛋白融合表達
    4.2 T7g10與omega增強子的插入
    4.3 三種重組菌α毒素蛋白表達量ELISA結果比較分析
    4.4 三種重組菌mRNA轉錄水平比較分析
    4.5 重組菌的蛋白表達量流式細胞術結果比較分析
    4.6 重組菌表面表達蛋白的間接免疫熒光與激光共聚焦分析
    4.7 熒光定量PCR方法的應用
    4.8 組成型乳酸菌表面表達載體的應用前景
5 結論
致謝
參考文獻
附錄
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3700096