腫瘤進展位點2 （TPL2）在不同病毒感染過程中扮演著不同角色。為探究TPL2對塞內卡病毒（SVA）復制的影響,本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建TPL2基因敲除HEK293T細胞系,以PCR測序和Western-blot對TPL2敲除效率進行雙重鑒定,同時檢測TPL2缺失對細胞形態(tài)和細胞增殖速度的影響。最后,用SVA感染細胞,采用IFA、RT-qPCR、Western-blot和TCID₅₀方法檢測病毒增殖水平,綜合評價TPL2敲除對SVA復制的影響。結果,獲得兩株敲除TPL2基因的HEK293T細胞。隨機選取B1細胞株(HEK293T-TPL2^-/-)進行后續(xù)功能評價,發(fā)現(xiàn)TPL2敲除后細胞的增殖速度與對照HEK293T細胞無顯著差異,均為貼壁、上皮樣細胞形態(tài)。SVA感染后與對照細胞相比,敲除TPL2基因顯著增加病毒拷貝數(shù),病毒mRNA的轉錄,病毒蛋白的翻譯以及子代病毒的毒力。綜上所述,本研究成功建立TPL2基因敲除HEK293T細胞系并證明TPL2在SVA感染過程中發(fā)揮著抗病毒作用,為進一步揭示TPL2相關免疫反應和SVA... 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細胞、質粒與病毒
    1.2 試劑和抗體
    1.3 TPL2 oligo sgRNA引物的設計及合成
    1.4 重組質粒p X-EZ-TPL2-sgRNA的構建
    1.5 HEK293T細胞培養(yǎng)與轉染
    1.6 敲除TPL2基因的單克隆細胞株篩選
    1.7 TPL2基因敲除HEK293T細胞系的鑒定
    1.8 TPL2基因敲除HEK293T細胞系的細胞形態(tài)學觀察和增殖速度分析
    1.9 病毒感染
    1.1 0 Real-time Quantitative PCR(RT-qPCR)
    1.1 1 蛋白質免疫印跡試驗（Western-blot)
    1.1 2 間接免疫熒光（IFA)
    1.1 3 病毒感染力測定（TCID50)
    1.1 4 統(tǒng)計學分析
2 結果
    2.1 重組質粒pX-EZ-TPL2-sgRNA的構建
    2.2 TPL2基因敲除HEK293T細胞系的構建及鑒定
    2.3 TPL2基因敲除HEK293T細胞系形態(tài)和增殖速度分析
    2.4 TPL2基因敲除對SVA轉錄的影響
    2.5 TPL2基因敲除對SVA蛋白表達的影響
    2.6 TPL2基因敲除對SVA TCID50滴度的影響
3 討論
4 結論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]利用重組慢病毒載體共表達Cas9-sgRNA構建TLR4基因敲除DF1細胞系[J]. 龐中兵,王偉,劉賽寶,王輝,陳洪巖,孟慶文.  中國獸醫(yī)科學. 2018(08)



本文編號：3678283