新孢子蟲病是由犬新孢子蟲引起牛和其它動物的重要的原蟲病,該病可引起牛的流產(chǎn)、死胎及神經(jīng)系統(tǒng)障礙疾病,已給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對新孢子蟲病的防控目前尚無有效的方法。目前,以病毒為載體的疫苗得到了廣泛研究,其中腺病毒載體疫苗在寄生蟲領(lǐng)域也得到了應(yīng)用且卓見成效,而以DNA疫苗初免、病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫的策略在誘導(dǎo)接種動物體液免疫和細(xì)胞免疫方面顯示了良好的效果。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中（AB265823.1）已公布的犬新孢子蟲AMA1基因序列,設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增AMA1基因的兩對特異性引物,應(yīng)用RT-PCR方法對牛源犬新孢子蟲吉林株AMA1基因進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增的AMA1基因克隆至pMD18-T simple載體,將測序正確的AMA1基因分別亞克隆至pVAX-1真核表達(dá)載體與pCR259腺病毒穿梭載體。將構(gòu)建的pVAX1-AMA1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),并通過間接免疫熒光和western blot檢測其表達(dá)產(chǎn)物,之后通過質(zhì)粒中提試劑盒大提pVAX1-AMA1質(zhì)粒,制備核酸疫苗。同時(shí)將構(gòu)建的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-NcAMAl依次轉(zhuǎn)化HighQ-1Transpose-A... 

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
    1 概述
        1.1 新孢子蟲
        1.2 新孢子蟲的生活史
        1.3 新孢子蟲病
    2 免疫學(xué)研究
    3 新孢子蟲病的防治
    4 新孢子蟲抗原
    5 腺病毒載體
    6 Prime-Boost免疫策略
    7 研究目的與意義
材料與方法
    1 材料
        1.1 蟲株與細(xì)胞株
        1.2 載體與實(shí)驗(yàn)動物
        1.3 血清、培養(yǎng)液及二抗
        1.4 主要試劑
        1.5 主要儀器設(shè)備
        1.6 試驗(yàn)所需主要溶液
    2 方法
        2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.2 細(xì)胞和蟲體培養(yǎng)
        2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.4 蟲體總RNA的提取
        2.5 犬新孢子蟲AMA1基因的擴(kuò)增
        2.6 PCR產(chǎn)物的純化
        2.7 犬新孢子蟲AMA1基因的克隆
        2.8 重組pVAX1-AMA1質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.9 重組質(zhì)粒pVAX1-AMA1的大量提取
        2.10 重組質(zhì)粒pVAX1-AMA1的表達(dá)
        2.11 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-AMA1的構(gòu)建
        2.12 AMA1基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.13 AMA1基因重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒的線性化
        2.14 AMA1基因重組腺病毒的包裝
        2.15 重組腺病毒Ad5-NcAMA1的鑒定
        2.16 重組腺病毒Ad5-NcAMA1 TCID_(50)的測定
        2.17 動物免疫試驗(yàn)
        2.18 小鼠血清中抗體水平的檢測
        2.19 小鼠血清中IgG1、IgG2a水平檢測
        2.20 小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平檢測
        2.21 CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群測定
        2.22 數(shù)據(jù)分析
結(jié)果
    1 AMA1基因的擴(kuò)增
    2 重組質(zhì)粒pMD18-AMA1的鑒定
    3 重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-AMA1的鑒定
    4 pVAX1-AMA1質(zhì)粒中AMA1基因表達(dá)的鑒
        4.1 間接免疫熒光檢測AMA1基因的表達(dá)
        4.2 Western blot檢測AMA1基因的表達(dá)
    5 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-AMA1的鑒定
    6 重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒294-AMA1的鑒定
    7 AMA1基因重組腺病毒的包裝
    8 重組腺病毒Ad5-NcAMA1的鑒定
        8.1 PCR檢測AMA1基因
        8.2 間接免疫熒光檢測AMA1基因的表達(dá)
        8.3 Western blot檢測AMA1基因的表達(dá)
    9 重組腺病毒Ad5-NcAMA1病毒滴度測定
    10 BALB/c小鼠血清中的特異性抗體檢測結(jié)果
        10.1 IgG檢測結(jié)果
        10.2 IgG1檢測結(jié)果
        10.3 IgG2a檢測結(jié)果
    11 BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞亞群含量檢測
    12 外周血中細(xì)胞因子水平檢測
        12.1 IL-4檢測結(jié)果
        12.2 IFN-γ檢測結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄A (作者簡介)
附錄B (在研期間發(fā)表的論文)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]U937單核細(xì)胞幾種不同轉(zhuǎn)染方法的比較[J]. 潘俊杰,施海明,羅心平,李劍,梁旺,張進(jìn),馬端.  復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2010(05)
[2]河南地區(qū)PRRS的病原分離鑒定及血清學(xué)調(diào)查[J]. 趙坤,李敬璽,王三虎,王麗榮,王承民,李軍民.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2005(09)



本文編號：3672812