發(fā)布時間：2022-08-04 11:53

　　單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenesis,LM）是一種在環(huán)境中普遍存在的革蘭氏陽性菌,能引起人和動物嚴(yán)重的食源性感染,致病率高達(dá)30%-40%。自溶素是在細(xì)菌中普遍存在的肽聚糖水解酶,與細(xì)菌的多種生物學(xué)功能有關(guān),參與細(xì)菌的致病過程。目前,已經(jīng)從單核細(xì)胞增生性李斯特菌中鑒定出8種自溶素蛋白。單核細(xì)胞增生性李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e（1/2a血清型）全基因組序列分析及轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)研究表明lmo1521基因含假定酰胺酶結(jié)構(gòu)域及GW模塊,在侵染小鼠時該基因表達(dá)量上調(diào),預(yù)測其可能是自溶素基因。本研究用實驗證據(jù)鑒定該基因是自溶素基因。本實驗以單核細(xì)胞增生性李斯特菌lmo1521基因CDS區(qū)域為目標(biāo)基因序列,構(gòu)建pET-22b-lmo1521重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至蛋白表達(dá)宿主菌E.coliBL21（DE3）,用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）為誘導(dǎo)劑,原核表達(dá)得到可溶性Lmo1521重組蛋白,用Ni-NTA樹脂純化重組蛋白,從而得到高純度、高濃度目標(biāo)蛋白Lmo1 521。綜合采用多種方法研究Lmo1521蛋白是否具有細(xì)胞壁水解酶活性。首先以提純的單增李斯特菌細(xì)胞壁為底物,... 

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 前言
    1.2 單增李斯特菌中的自溶素
    1.3 自溶素的結(jié)構(gòu)
        1.3.1 信號肽序列
        1.3.2 肽聚糖水解酶域
        1.3.3 細(xì)胞壁錨定域
    1.4 自溶素在細(xì)菌致病過程中的作用
        1.4.1 參與細(xì)胞粘附與侵襲
        1.4.2 參與細(xì)菌生存與繁殖
        1.4.3 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)
        1.4.4 參與細(xì)菌毒力
    1.5 自溶素的調(diào)控機(jī)制
        1.5.1 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控
        1.5.2 自我抑制
        1.5.3 肽聚糖結(jié)構(gòu)修飾
        1.5.4 pH調(diào)控
    1.6 選題依據(jù)及研究內(nèi)容
    1.7 研究目的及意義
2 單核細(xì)胞增生性李斯特菌lmo1521基因的表達(dá)及產(chǎn)物純化
    2.1 實驗材料、主要試劑、試劑配制和儀器設(shè)備
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 試劑配制
        2.1.4 儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 lmo1521基因的原核表達(dá)
        2.2.2 SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)蛋白
        2.2.3 表達(dá)蛋白的可溶性分析
        2.2.4 Ni-NTA樹脂純化表達(dá)蛋白
        2.2.5 Ni-NTA樹脂的再生
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 lmo1521基因表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)mo1521蛋白
        2.3.2 Lmo1521蛋白為可溶性蛋白
        2.3.3 Ni-NTA親和純化獲得高純度Lmo1521蛋白
3 Lmo1521蛋白細(xì)胞壁水解酶活性分析
    3.1 實驗材料、主要試劑、試劑配制和儀器設(shè)備
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 試劑配制
        3.1.4 儀器設(shè)備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 單核細(xì)胞增生性李斯特菌和大腸桿菌細(xì)胞壁的制備
        3.2.2 復(fù)性SDS-PAGE電泳分析Lmo1521細(xì)胞壁水解酶活性
        3.2.3 革蘭氏染色觀察Lmo1521蛋白對單增李斯特菌活細(xì)胞的破壞作用
        3.2.4 過表達(dá)的Lmo1521蛋白對宿主菌生長的影響
        3.2.5 Lmo1521蛋白對不同底物降解活性的研究
        3.2.6 Lmo1521蛋白最適水解pH值的研究
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 復(fù)性SDS-PAGE電泳證明Lmo1521蛋白具有水解自身細(xì)胞壁的活性
        3.3.2 Lmo1521蛋白能夠破壞單增李斯特菌活細(xì)胞
        3.3.3 過表達(dá)的Lmo1521蛋白抑制宿主菌的生長
        3.3.4 Lmo1521蛋白水解不同的細(xì)胞壁底物
        3.3.5 Lmo1521蛋白最適水解pH值為中堿性
    3.4 討論
4 構(gòu)建pMAD△lmo1521重組質(zhì)粒
    4.1 實驗材料、主要試劑和儀器設(shè)備
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 構(gòu)建pMAD△lmo1521重組質(zhì)粒所用的特異性PCR引物
        4.1.4 儀器設(shè)備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 提取單核細(xì)胞增生性李斯特菌基因組DNA
        4.2.2 提取pET-28a(+)質(zhì)粒DNA
        4.2.3 提取pMAD質(zhì)粒DNA
        4.2.4 PCR擴(kuò)增lmo1520、kanamycin及l(fā)mo1522基因
        4.2.5 SOE-PCR拼接lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段
        4.2.6 插入片段及連接載體的制備
        4.2.7 pMAD質(zhì)粒與lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段的連接
        4.2.8 pMAD△lmo1521重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        4.2.9 菌落PCR及雙酶切驗證pMAD△lmo1521重組質(zhì)粒
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 SOE-PCR產(chǎn)物:lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段
        4.3.2 菌落PCR驗證檢測pMAD△lmo1521重組質(zhì)粒
        4.3.3 pMAD△lmo1521重組質(zhì)粒的雙酶切驗證
5 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 論文創(chuàng)新點
    5.3 課題展望
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]單增李斯特菌在蜂產(chǎn)品中快速檢測方法的建立及其自溶素基因lmo1521的功能鑒定[D]. 張紅娟.中國計量學(xué)院 2012



本文編號：3669491