雞蛋中的卵黃高磷蛋白（phosvitin）是已知所有蛋白質中磷酸化程度最高的蛋白質,含磷量占蛋黃總磷量的80%,是雞胚骨骼發(fā)育中礦物質磷的主要來源。本文以phosvitin作為研究對象,圍繞著phosvitin對雞胚胎骨骼發(fā)育的影響開展了系列工作。主要研究內容和研究成果摘要如下：研究了雞胚胎發(fā)育期間與骨骼發(fā)育相關指標的變化規(guī)律。發(fā)現雞胚胎發(fā)育9-10d是一個轉折點：蛋清pH在9d胚齡以后,逐漸趨于穩(wěn)定,保持在pH7.5左右；蛋黃pH在10d胚齡時突然上升,達到最大值8.19,之后呈小幅度下降,在pH7.5附近相對穩(wěn)定；蛋黃總磷含量在10d胚齡時出現急劇下降,這與胚胎在9d胚齡開始骨化有很大相關性。比較分析蛋黃磷含量的降低速率、堿性磷酸酶活力變化以及雞胚體長的增長發(fā)現三者的變化趨勢基本一致,先上升后下降。在14-16d總磷下降速率最快,平均達到0.027mg/g.d, ALP活力也達到最大值1.12U/gprot,體長增長率的變化有一定滯后,在17d胚齡增長率達到最大,1.17cm/d,這與蛋黃中的磷被轉移到胚胎然后被胚胎骨骼發(fā)育利用需要一定時間有關。研究了胚胎發(fā)育的9-20d phos... 

【文章頁數】：95 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
第一章 文獻綜述
    1 生物礦化的概述
    2 生物礦化與蛋白調控
    3 磷蛋白對生物礦化的影響
        3.1 骨橋蛋白與生物礦化
        3.2 骨唾液酸蛋白與生物礦化
        3.3 牙本質磷蛋白與生物礦化
        3.4 牙本質基質蛋白與生物礦化
    4 Phosvitin與生物礦化
        4.1 Phosvitin的組成和結構
        4.2 Phosvitin與生物礦化
    5 細胞培養(yǎng)技術在生物礦化中的應用
        5.1 成骨細胞
        5.2 體外成骨細胞分離培養(yǎng)的應用
        5.3 骨形成有關的生化指標
            5.3.1 堿性磷酸酶(ALP)
            5.3.2 骨鈣蛋白(OCN)
            5.3.3 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)
            5.3.4 核心結合因子(Runx-2)
            5.3.5 Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)
    6 實時定量RT-PCR技術在生物礦化研究中的應用
    7 本課題選題的學術思想
        7.1 研究目的和意義
        7.2 學術思路
        7.3 主要研究內容
第二章 雞胚胎發(fā)育期間與骨骼發(fā)育相關指標的測定
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 原料
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器和設備
        1.2 方法
            1.2.1 實驗設計
            1.2.2 蛋黃樣品的采集
            1.2.3 蛋清蛋黃pH測定
            1.2.4 蛋黃中鈣磷含量的測定
            1.2.5 胚胎脛骨中ALP活性的測定
            1.2.6 胚胎體長及脛骨長度測定
            1.2.7 數據處理
    2 結果與分析
        2.1 孵化期間蛋清、蛋黃pH值的變化
        2.2 孵化期間蛋黃中總鈣、總磷含量的變化
        2.3 孵化期間雞胚脛骨中堿性磷酸酶(ALP)活力的變化
        2.4 孵化期間雞胚脛骨長度及雞胚體長的變化
        2.5 相關性分析
    3 討論
    4 小結
第三章 雞胚胎發(fā)育過程中phosvitin的變化
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 原料
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器和設備
        1.2 方法
            1.2.1 實驗設計
            1.2.2 蛋黃樣品的采集
            1.2.3 phosvitin的分離與純化
            1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
            1.2.5 Phosvitin中有機磷含量的測定
            1.2.6 Phosvitin中有機氮含量的測定
            1.2.7 磷蛋比(P/N radio)的計算
            1.2.8 紅外光譜測定
            1.2.9 圓二色譜測定
            1.2.10 數據處理
    2 結果與分析
        2.1 孵化期間phosvitin分子量測定
        2.2 孵化期間phosvitin磷氮比的變化
        2.3 孵化期間phosvitin紅外吸收圖譜分析
        2.4 孵化期間phosvitin二級結構的變化
            2.4.1 紅外光譜分析法
            2.4.2 圓二色譜分析法
    3 討論
    4 小結
第四章 Phosvitin對MC3T3-E1細胞生長的影響
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 原料
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器和設備
        1.2 方法
            1.2.1 實驗設計
            1.2.2 Phosvitin提取純化
            1.2.3 細胞培養(yǎng)操作程序
            1.2.4 CCK-8法測定細胞增殖
            1.2.5 流式細胞儀測定細胞周期
            1.2.6 MC3T3-E1細胞凋亡率的檢測(流式法)
            1.2.7 數據處理
    2 結果與分析
        2.1 Phosvitin純度鑒定
        2.2 MC3T3-E1細胞生長曲線的測定
        2.3 Phosvitin對MC3T3-E1細胞活力的影響
        2.4 Phosvitin對MC3T3-E1細胞周期的影響
        2.5 Phosvitin對MC3T3-E1細胞凋亡的影響
    3 討論
    4 小結
第五章 Phosvitin對MC3T3-E1細胞礦化的影響
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 原料
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器和設備
        1.2 方法
            1.2.1 實驗設計
            1.2.2 Phosvitin提取純化
            1.2.3 細胞培養(yǎng)操作程序
            1.2.4 成骨細胞中ALP活性測定
            1.2.5 礦化結節(jié)茜素紅染色
            1.2.6 MC3T3-E1細胞總RNA提取與RT-PCR反應
            1.2.7 數據處理
    2 結果與分析
        2.1 誘導礦化實驗的接種密度的確立
        2.2 茜素紅染色結果
        2.3 堿性磷酸酶(ALP)活力測定結果
        2.4 MC3T3-E1誘導礦化相關基因mRNA表達量的測定
            2.4.1 不同礦化誘導劑對Runx-2 mRNA表達量的影響
            2.4.2 不同礦化誘導劑對BMP-2 mRNA表達量的影響
            2.4.3 不同礦化誘導劑對Col-Ⅰ mRNA表達量的影響
            2.4.4 不同礦化誘導劑對OCN mRNA表達量的影響
    3 討論
    4 小結
第六章 結論和展望
    1 結論
    2 創(chuàng)新性
    3 延續(xù)研究計劃
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]益骨膠囊含藥血清對共育體系中成骨細胞表達骨保護素mRNA的影響[J]. 徐立群,張榮華,傅淑平,楊麗.  中華生物醫(yī)學工程雜志. 2012 (02)
[2]AA3型連續(xù)流動分析儀測定土壤和植物全氮的方法研究[J]. 張英利,許安民,尚浩博,馬愛生.  西北農林科技大學學報(自然科學版). 2006(10)
[3]骨代謝標志物研究進展[J]. 陶慶樹,周振雷,胡丹,侯加法.  畜牧與獸醫(yī). 2006(02)
[4]雞類胰島素生長因子Ⅰ的克隆、表達及其表達產物的生物學活性研究[J]. 張建峰,侯加法,張皎,姚靜.  中國農業(yè)科學. 2005(10)
[5]山羊成骨細胞的體外培養(yǎng)和鑒定[J]. 鐘代彬,吳培福,曲偉杰,王梅,蘇敬良,金久善,韓博.  中國獸醫(yī)科技. 2005(05)
[6]體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞實驗模型的建立[J]. 劉莉,常紅,黃國偉,王媛,白紹蓓.  天津醫(yī)科大學學報. 2004(01)
[7]成骨細胞分化產物及其生化標志研究進展[J]. 徐青,田秀巧,張會豐.  臨床薈萃. 2003(01)
[8]條件培養(yǎng)液對兔骨髓基質細胞向成骨細胞分化的影響[J]. 武和明,邢樹忠,張曉旻.  醫(yī)學研究生學報. 2002(01)
[9]降鈣素對體外培養(yǎng)成骨細胞的影響[J]. 朱建民,方浩,陳新剛,曾明,金蔚芳,王洪復.  中國骨質疏松雜志. 2001(02)
[10]水溶性BSA-羥基磷灰石-碳酸鈣復合物的形成機理[J]. 沈玉華,楊展瀾,謝安鍵,吳瑾光.  光譜學與光譜分析. 2000(06)

博士論文
[1]蛋白調控骨、牙礦化的研究及模擬[D]. 程振江.清華大學 2010



本文編號：3663280