鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒引起的一種新發(fā)病毒病，病鴨主要表現(xiàn)為高熱、食欲下降、產(chǎn)蛋下降，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失。本研究利用前期分離鑒定得到的一株強(qiáng)毒株FX2010株，建立了該毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為研究該病毒分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。為建立FX2010株的反向遺傳操作系統(tǒng)，首先提取病毒的RNA，利用RT-PCR方法，分片段擴(kuò)增了病毒的全基因組，相鄰片段的末端序列相互重疊。病毒基因組4020位之前的片段通過融合PCR的方式擴(kuò)增得到，作為全長(zhǎng)基因的前半段；根據(jù)病毒基因組中單一酶切位點(diǎn)的位置，將病毒基因組的3656位至10991位的序列克隆至pSIMPLE18平端載體上，從而得到覆蓋鴨坦布蘇病毒后半段基因組的質(zhì)粒3-N-pSIMPLE。在5’端引入T7啟動(dòng)子，用ApaLI酶切3-N-pSIMPLE得到后半段，利用融合PCR的方法得到該病毒的全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物。然后利用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備具有感染性的病毒體外轉(zhuǎn)錄本，純化后轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞并注意觀察細(xì)胞變化，與對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染病毒RNA的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48h后開始出現(xiàn)病變，72h出現(xiàn)明顯病變。經(jīng)過RT-PCR，間接免疫熒光（I... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)與縮略語(yǔ) 中文摘要 Abstract 1 前言
1.1 鴨坦布蘇病毒概述
1.2 分子生物學(xué)特性
    1.2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)
    1.2.2 在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制
    1.2.3 培養(yǎng)特性
1.3 鴨坦布蘇病毒的研究進(jìn)展
1.4 反向遺傳操作系統(tǒng)概述
    1.4.1 RNA 病毒的反向遺傳技術(shù)
    1.4.2 黃病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.4.3 黃病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的應(yīng)用
1.5 研究的目的及意義 2 材料與方法
2.1 材料
    2.1.1 病毒和細(xì)胞
    2.1.2 主要試劑
2.2 方法
    2.2.1 FX2010 株感染性 DNA 的構(gòu)建
    
2.2.1.1 病毒核酸提取
    
2.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄
    
2.2.1.3 全長(zhǎng)序列的分片段引物設(shè)計(jì)及克隆策略
    
2.2.1.4 全長(zhǎng)分片段 PCR 擴(kuò)增
    
2.2.1.5 克隆構(gòu)建
    
2.2.1.6 FX2010 株全長(zhǎng) DNA 的獲取
    2.2.2 FX2010 株病毒的拯救
    
2.2.2.1 體外轉(zhuǎn)錄
    
2.2.2.2 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化
    
2.2.2.3 轉(zhuǎn)染
    
2.2.2.4 拯救病毒的鑒定
    2.2.3 基因重配病毒的拯救
    
2.2.3.1 基因重配病毒基因組構(gòu)建策略
    
2.2.3.2 基因重配病毒全長(zhǎng) DNA 的獲得 3 結(jié)果與分析
3.1 FX2010 株分片段擴(kuò)增結(jié)果
3.2 FX2010 株融合全長(zhǎng)兩半端電泳結(jié)果
3.3 FX2010 株全長(zhǎng) DNA 電泳圖
3.4 FX2010 株病毒拯救結(jié)果
    3.4.1 細(xì)胞病變
    3.4.2 RT-PCR 鑒定結(jié)果
    3.4.3 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果
    3.4.4 雞胚致病性試驗(yàn)結(jié)果
    3.4.5 序列比對(duì)結(jié)果
3.5 基因重配病毒的拯救結(jié)果
    3.5.1 電泳結(jié)果
    3.5.2 細(xì)胞病變
    3.5.3 測(cè)序比對(duì)結(jié)果 4 討論
4.1 反向遺傳操作系統(tǒng)
4.2 基因重配病毒研究 5 結(jié)論 參考文獻(xiàn) 附錄 致謝 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[9]一種引起蛋雞產(chǎn)蛋下降的新型黃病毒的分離與初步鑒定[J]. 陳仕龍,陳少鶯,王劭,林鋒強(qiáng),江斌,程曉霞,黃梅清,朱小麗,李兆龍.  福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2011(02)
[10]鴨傳染性產(chǎn)蛋減少癥(暫定名)的病原分離初報(bào)[J]. 廖敏,牟小東,耿陽(yáng),邊葶藶,陸新浩,陳秋英,任祖伊,丁鏟,周繼勇.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2011(01)

碩士論文
[1]鴨坦布蘇病毒分離鑒定及其生物學(xué)特性的研究[D]. 顏丕熙.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012



本文編號(hào)：3659604