鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus, MHV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬（Coronavirus）,是一種單股正鏈RNA病毒,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中帶毒小鼠存在非常廣泛,在各實(shí)驗(yàn)室中均有發(fā)現(xiàn)。而其中不同類型、不同毒株病毒在不同年齡、品系和免疫狀態(tài)的小鼠中均可發(fā)現(xiàn),并且可引起肝炎、腦脊髓炎和腸炎等許多不同癥狀。在很多情況下,我們可以發(fā)現(xiàn)帶毒小鼠呈隱性感染的占有很大比重,然而在鼠肝炎病毒與某些微生物發(fā)生混合感染時(shí),或是在某些條件的刺激下我們會(huì)發(fā)現(xiàn)有疾病的爆發(fā),鼠肝炎病毒是嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染的各種病毒中最難清除的病毒之一。感染鼠肝炎病毒的鼠群,其各種免疫應(yīng)答參數(shù)會(huì)發(fā)生改變,對(duì)十實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生各種影響,因此本實(shí)驗(yàn)開展了該病間接ELISA快速診斷方法的研究。本文首先根據(jù)GenBank中公布的MHV-A59N基因序列（AY700211）,加入酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,然后通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出N基因的主要抗原片段NS片段,將目的片段純化后與pMD18-T載體連接得到重組質(zhì)粒pMD18-T-N,雙酶切膠回收目的基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-3... 

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鼠肝炎病毒研究進(jìn)展
    1.2 鼠肝炎病毒的結(jié)構(gòu)特征
    1.3 鼠肝炎病毒的分子特征
    1.4 鼠肝炎病毒理化特征
    1.5 鼠肝炎流行病學(xué)
    1.6 臨床癥狀及病理變化
    1.7 鼠肝炎病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響
    1.8 診斷方法的研究
    1.9 預(yù)防和控制
    1.10 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒株、細(xì)胞株、菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 主要工具酶、抗體及分子生物學(xué)試劑盒
        2.1.4 主要藥品及試劑
        2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 MHV-A59 N基因的獲得及原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的構(gòu)建
        2.2.2 重組蛋白的表達(dá)
        2.2.3 MHV N蛋白多克隆抗體的制備
        2.2.4 MHV間接ELISA檢測(cè)方法的建立
        2.2.5 MHV間接ELISA檢測(cè)方法的初步應(yīng)用
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 MHV-N蛋白多克隆抗體制備
        3.1.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的構(gòu)建
        3.1.2 MHGN蛋白的原核表達(dá)
        3.1.3 原核表達(dá)蛋白的純化
        3.1.4 多抗血清檢測(cè)
    3.2 間接ELISA檢測(cè)方法的建立
        3.2.1 抗原最適濃度
        3.2.2 血清最適濃度
        3.2.3 血清最適作用時(shí)間
        3.2.4 酶標(biāo)抗體最佳作用濃度
        3.2.5 酶標(biāo)抗體最佳作用時(shí)間
        3.2.6 封閉液的選擇
        3.2.7 敏感性結(jié)果
        3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
        3.2.9 與間接免疫熒光比較
    3.3 間接ELISA檢測(cè)方法的應(yīng)用
4 討論
    4.1 表達(dá)蛋白基因的選擇
    4.2 連接轉(zhuǎn)化條件的選擇
    4.3 原核表達(dá)載體的選擇
    4.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
    4.5 蛋白的純化
    4.6 ELISA檢測(cè)方法條件的摸索
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3659598