鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus, MHV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬（Coronavirus）,是一種單股正鏈RNA病毒,在實驗動物中帶毒小鼠存在非常廣泛,在各實驗室中均有發(fā)現(xiàn)。而其中不同類型、不同毒株病毒在不同年齡、品系和免疫狀態(tài)的小鼠中均可發(fā)現(xiàn),并且可引起肝炎、腦脊髓炎和腸炎等許多不同癥狀。在很多情況下,我們可以發(fā)現(xiàn)帶毒小鼠呈隱性感染的占有很大比重,然而在鼠肝炎病毒與某些微生物發(fā)生混合感染時,或是在某些條件的刺激下我們會發(fā)現(xiàn)有疾病的爆發(fā),鼠肝炎病毒是嚙齒類實驗動物感染的各種病毒中最難清除的病毒之一。感染鼠肝炎病毒的鼠群,其各種免疫應(yīng)答參數(shù)會發(fā)生改變,對十實驗結(jié)果產(chǎn)生各種影響,因此本實驗開展了該病間接ELISA快速診斷方法的研究。本文首先根據(jù)GenBank中公布的MHV-A59N基因序列（AY700211）,加入酶切位點與保護(hù)性堿基設(shè)計了一對特異性引物,然后通過RT-PCR擴(kuò)增出N基因的主要抗原片段NS片段,將目的片段純化后與pMD18-T載體連接得到重組質(zhì)粒pMD18-T-N,雙酶切膠回收目的基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-3... 

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鼠肝炎病毒研究進(jìn)展
    1.2 鼠肝炎病毒的結(jié)構(gòu)特征
    1.3 鼠肝炎病毒的分子特征
    1.4 鼠肝炎病毒理化特征
    1.5 鼠肝炎流行病學(xué)
    1.6 臨床癥狀及病理變化
    1.7 鼠肝炎病毒對實驗的影響
    1.8 診斷方法的研究
    1.9 預(yù)防和控制
    1.10 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 病毒株、細(xì)胞株、菌株
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 主要工具酶、抗體及分子生物學(xué)試劑盒
        2.1.4 主要藥品及試劑
        2.1.5 主要實驗儀器設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 MHV-A59 N基因的獲得及原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的構(gòu)建
        2.2.2 重組蛋白的表達(dá)
        2.2.3 MHV N蛋白多克隆抗體的制備
        2.2.4 MHV間接ELISA檢測方法的建立
        2.2.5 MHV間接ELISA檢測方法的初步應(yīng)用
3 實驗結(jié)果
    3.1 MHV-N蛋白多克隆抗體制備
        3.1.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N的構(gòu)建
        3.1.2 MHGN蛋白的原核表達(dá)
        3.1.3 原核表達(dá)蛋白的純化
        3.1.4 多抗血清檢測
    3.2 間接ELISA檢測方法的建立
        3.2.1 抗原最適濃度
        3.2.2 血清最適濃度
        3.2.3 血清最適作用時間
        3.2.4 酶標(biāo)抗體最佳作用濃度
        3.2.5 酶標(biāo)抗體最佳作用時間
        3.2.6 封閉液的選擇
        3.2.7 敏感性結(jié)果
        3.2.8 穩(wěn)定性試驗結(jié)果
        3.2.9 與間接免疫熒光比較
    3.3 間接ELISA檢測方法的應(yīng)用
4 討論
    4.1 表達(dá)蛋白基因的選擇
    4.2 連接轉(zhuǎn)化條件的選擇
    4.3 原核表達(dá)載體的選擇
    4.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
    4.5 蛋白的純化
    4.6 ELISA檢測方法條件的摸索
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3659598