發(fā)布時(shí)間：2022-07-07 14:46

　　由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）引起的豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是一種廣泛存在于我國豬場并嚴(yán)重影響我國生豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的病原體。Mhp因其特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)而沒有特效治療藥物,對(duì)常規(guī)的藥物又極易產(chǎn)生耐藥性,豬場一旦發(fā)生MPS就很難控制,因此做好免疫防控成了減少M(fèi)PS損失的唯一有效途徑。Mhp的培養(yǎng)條件苛刻,且培養(yǎng)物滴度較低,這直接影響了Mhp常規(guī)疫苗的研制與應(yīng)用。所以,開發(fā)出一種成本低廉,效果確實(shí)的Mhp疫苗成了養(yǎng)豬業(yè)迫切的需求。本研究運(yùn)用重組腺病毒載體表達(dá)技術(shù),將Mhp的主要抗原基因粘附因子P97全基因重組到腺病毒穿梭載體,用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將重組穿梭載體pacAd5 Shuttle-P97與骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞AD293中,構(gòu)建出了重組腺病毒Ad-P97,并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了檢測與評(píng)價(jià),得到了以下試驗(yàn)結(jié)果:（1）利用KM₂培養(yǎng)基培養(yǎng)Mhp,離心收集菌體并提取其基因組DNA。以基因組DNA為模板,采用分段PCR的方式分別擴(kuò)增了P97的前后兩段基因,再利用酶切、連... 

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞對(duì)照
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬肺炎支原體的研究概況
        1.1.1 病原學(xué)
        1.1.2 流行病學(xué)
        1.1.3 發(fā)病機(jī)制
        1.1.4 臨床癥狀及病理變化
    1.2 豬肺炎支原體基因組結(jié)構(gòu)及主要抗原蛋白
        1.2.1 豬肺炎支原體基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.2粘附因子P97與P102
        1.2.3膜蛋白P46和P65
        1.2.4 熱休克蛋白Dnak
        1.2.5細(xì)胞質(zhì)蛋白P36
    1.3 國內(nèi)外豬肺炎支原體疫苗研究進(jìn)展
        1.3.1 MPS常規(guī)疫苗
        1.3.2 MPS基因工程疫苗
    1.4 腺病毒載體的研究進(jìn)展
        1.4.1 重組腺病毒載體的構(gòu)建策略
        1.4.2 腺病毒載體的大量擴(kuò)增與純化
        1.4.3 腺病毒載體的安全性
    1.5 研究的目的與意義
        1.5.1 研究目的
        1.5.2 研究意義
2 豬肺炎支原體粘附因子P97全基因的克隆
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)用豬肺炎支原體菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 相關(guān)溶液系統(tǒng)配制方法
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 Mhp標(biāo)準(zhǔn)株的復(fù)蘇與擴(kuò)大培養(yǎng)
        2.2.2 Mhp基因組基因的提取
        2.2.3 PCR引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2.4 P97全基因的PCR擴(kuò)增
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 Mhp基因組DNA提取濃度測定結(jié)果
        2.3.2 分段PCR結(jié)果
        2.3.3 目的基因P97前與P97后的酶切結(jié)果
        2.3.4 連接及P97全基因擴(kuò)增結(jié)果
    2.4 討論
3 穿梭載體pacAd5 Shuttle-P97的構(gòu)建與P97基因序列分析
    3.1 材料
        3.1.1 主要試劑
        3.1.2 相關(guān)培養(yǎng)基配制
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.2 腺病毒表達(dá)載體質(zhì)粒的擴(kuò)增與純化
        3.2.3 重組穿梭質(zhì)粒pacAd5 Shuttle-P97的構(gòu)建
        3.2.4 重組穿梭質(zhì)粒pacAd5 Shuttle-P97的測序與序列分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 腺病毒表達(dá)載體質(zhì)粒的擴(kuò)增純化結(jié)果
        3.3.2 穿梭質(zhì)粒與P97基因雙酶切結(jié)果
        3.3.3 重組穿梭質(zhì)粒pacAd5 Shuttle-P97的構(gòu)建
        3.3.4 重組穿梭質(zhì)粒pacAd5 Shuttle-P97的測序結(jié)果
    3.4 討論
4 P97基因的定點(diǎn)突變
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 重疊延伸PCR結(jié)果
        4.2.2 重組穿梭質(zhì)粒pacAd5 Shuttle-TB-P97的測序結(jié)果與比對(duì)
    4.3 討論
5 重組腺病毒pacAd5-P97的構(gòu)建
    5.1 材料
        5.1.1 試驗(yàn)材料
        5.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
        5.1.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑
        5.1.4 免疫印跡相關(guān)試劑
        5.1.5 免疫熒光相關(guān)試劑
        5.1.6 主要儀器
        5.1.7 主要溶液系統(tǒng)配制
    5.2 方法
        5.2.1 腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒的PacⅠ酶切
        5.2.2 包裝細(xì)胞AD293細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
        5.2.3 轉(zhuǎn)染
        5.2.4 重組腺病毒Ad-P97的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)鑒定
        5.2.5 免疫印跡(Western-blot)檢測P97蛋白的表達(dá)
        5.2.6 重組腺病毒Ad-P97和Ad-GFP在PK15細(xì)胞中的表達(dá)
        5.2.7 重組腺病毒Ad-P97以及Ad-GFP的大量擴(kuò)增及滴度測定
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒的PacⅠ單酶切
        5.3.2 重組腺病毒Ad-P97與Ad-GFP的構(gòu)建
        5.3.3 重組腺病毒的鑒定結(jié)果
        5.3.4 重組腺病毒的滴度測定結(jié)果
    5.4 討論
6 重組腺病毒疫苗Ad-P97的免疫效果初步評(píng)價(jià)
    6.1 材料
        6.1.1 試驗(yàn)材料
        6.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組
        6.1.3 主要試劑及耗材
        6.1.4 主要儀器
        6.1.5 相關(guān)溶液系統(tǒng)配制
    6.2 方法
        6.2.1 Ad-P97的小鼠免疫及其免疫效果評(píng)價(jià)
        6.2.2 Ad-P97抗血清對(duì)Mhp黏附宿主細(xì)胞的阻斷作用
        6.2.3 Ad-P97對(duì)仔豬免疫效果測定
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果
        6.3.2 免疫小鼠血清中P97抗體水平
        6.3.3 Ad-P97抗血清對(duì)Mhp黏附PK15細(xì)胞的阻斷作用
        6.3.4 玻片凝集試驗(yàn)檢測仔豬血清抗體水平
    6.4 討論
7 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介
導(dǎo)師簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬肺炎支原體致病機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 李彥偉,劉茂軍,武昱孜,張旭,李桂蘭,張映,邵國青.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2013(08)
[2]豬肺炎支原體主要抗原蛋白的研究進(jìn)展[J]. 張悅,劉茂軍,邵國青.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2013(02)
[3]豬肺炎支原體黏附宿主細(xì)胞間接免疫熒光檢測方法的建立[J]. 車巧林,熊祺琰,馮志新,張旭,劉茂軍,邵國青.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(05)
[4]豬氣喘病的診斷與防制措施[J]. 李鳳仙,熊梅,唐春華.  科技信息. 2012(25)
[5]豬肺炎支原體地方毒株P(guān)97-R1基因序列分析及原核表達(dá)[J]. 賈麗艷,高玉花,張映.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2012(20)
[6]PCR技術(shù)檢測豬肺炎支原體的研究進(jìn)展[J]. 張旭,白方方,武昱孜,劉茂軍,馮志新,熊祺琰,張映,邵國青.  生物技術(shù)通報(bào). 2012(05)
[7]豬肺炎支原體P46基因的原核表達(dá)與間接ELISA方法的建立[J]. 沈青春,王芳,韓明遠(yuǎn),覃青松,范學(xué)政,楊漢春,寧宜寶.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(03)
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[9]重組人p53腺病毒注射液（今又生）臨床研究進(jìn)展[J]. 關(guān)大剛,鄭旭.  現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué). 2011(12)
[10]腺病毒載體用于基因治療的研究進(jìn)展[J]. 胡奇嬋,陳玥,王麗,楊舉倫.  解放軍醫(yī)藥雜志. 2011(05)

碩士論文
[1]豬肺炎支原體P97蛋白單克隆抗體的制備[D]. 王亮.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2008



本文編號(hào)：3656615