豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起一種高度接觸性和高致死性傳染病,給世界各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重危害。近年來(lái),隨著CSFV研究的深入,新型疫苗的研制和先進(jìn)診斷方法的出現(xiàn),對(duì)控制CSF方面發(fā)揮了巨大作用。NS2-3蛋白是CSFV的非結(jié)構(gòu)蛋白,具有很好的免疫優(yōu)勢(shì)。本研究從攜帶豬瘟兔化弱毒（Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV）全長(zhǎng)基因組c DNA質(zhì)粒中擴(kuò)增NS2-3基因的抗原表位集中區(qū)基因,擴(kuò)增長(zhǎng)度為789bp,將其命名為NS2-32。將目的片段和表達(dá)載體p PICZαC分別經(jīng)Eco R I和Xba I限制性內(nèi)切酶雙酶切,然后連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,得到重組表達(dá)質(zhì)粒p PICZαC-NS2-32。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序鑒定,重組表達(dá)質(zhì)粒p PICZαC-NS2-32經(jīng)Sac I限制性內(nèi)切酶單酶切線性化之后,電擊轉(zhuǎn)化至P.pastoris工程菌感受態(tài)X-33。篩選出高抗性陽(yáng)性菌株,通過(guò)改變溫度、培養(yǎng)基p H值、甲醇流加量,摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件,誘導(dǎo)條件包括:（1）誘導(dǎo)溫度為:22℃、24℃、26℃、28℃;（2）誘導(dǎo)p H值為:4.0、5.0、6.0、7.0... 

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞表
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 CSFV的結(jié)構(gòu)和特性
    2 CSFV的侵入機(jī)制
    3 CSFV的基因組和編碼蛋白
        3.1 C蛋白
        3.2 E~(rns)蛋白
        3.3 E1蛋白
        3.4 E2蛋白
        3.5 Npro蛋白
        3.6 p7蛋白
        3.7 NS2-3 蛋白
        3.8 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白
    4 CSF的實(shí)驗(yàn)室診斷
        4.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        4.2 病毒分離
        4.3 血清學(xué)診斷
        4.4 分子生物學(xué)診斷
        4.5 細(xì)胞檢查法
    5 CSFV新型疫苗研究進(jìn)展
        5.1 合成肽疫苗
        5.2 亞單位疫苗
        5.3 嵌合CSFV疫苗
        5.4 基因缺失型弱毒疫苗
        5.5 DNA疫苗
    6 P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)的一般特征
        6.1 外源基因的內(nèi)在特性的影響
        6.2 宿主菌的選擇
        6.3 表達(dá)載體
        6.4 發(fā)酵條件對(duì)表達(dá)的影響
第二章 CSFV NS2-3 蛋白抗原表位集中區(qū)的真核表達(dá)與鑒定
    1 材料
        1.1 質(zhì)粒和宿主菌
        1.2 主要試劑和酶類
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 主要試劑配制
    2 方法
        2.1 CSFV NS2-3_2 基因的PCR擴(kuò)增、克隆和鑒定
        2.2 重組克隆載體的構(gòu)建
        2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒p PICZαC-NS2-3_2 的構(gòu)建
        2.4 攜帶目的基因的重組酵母的構(gòu)建
        2.5 高抗性重組子的初步誘導(dǎo)表達(dá)
        2.6 誘導(dǎo)條件的摸索
        2.7 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定
        2.8 目的蛋白的Western blotting鑒定
    3 結(jié)果與分析
        3.1 目的基因的PCR擴(kuò)增
        3.2 重組克隆質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.3 重組克隆質(zhì)粒的菌液PCR鑒定
        3.4 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        3.5 CSFV NS2-3_2 和表達(dá)載體的連接
        3.6 重組表達(dá)質(zhì)粒p PICZαC-NS2-3_2 的PCR鑒定和雙酶切鑒定
        3.7 高抗性重組酵母菌的篩選
        3.8 高抗性重組酵母菌菌液PCR鑒定
        3.9 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
    4 討論
        4.1 密碼子偏嗜性
        4.2 A+T含量
        4.3 過(guò)度糖基化
        4.4 目的蛋白的降解
        4.5 甲醇的影響
        4.6 信號(hào)肽的影響
    5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的成績(jī)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
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