在畜牧生產(chǎn)中,骨骼肌生長發(fā)育及品質(zhì)性狀是評價產(chǎn)肉動物產(chǎn)肉性能的重要指標(biāo)。在骨骼肌發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,非編碼基因起著相當(dāng)重要的調(diào)控作用,如目前研究較多的microRNA和lncRNA。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA-SYISL能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖,抑制成肌細(xì)胞分化�；诖�,本研究通過生物信息學(xué)分析,預(yù)測miR-34b能夠結(jié)合SYISL,首先利用對miR-34b的抑制和過表達(dá)技術(shù)研究了miR-34b對成肌細(xì)胞增殖和分化的影響,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-34b可通過靶向SYISL來調(diào)控成肌細(xì)胞增殖和分化,具體的研究結(jié)果如下:1.利用熒光定量PCR技術(shù)研究了miR-34b在小鼠不同組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-34b在腿肌中高表達(dá),且在C2C12細(xì)胞分化過程中表達(dá)量逐漸上升。利用熒光定量PCR、Western Blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)研究了抑制和過表達(dá)miR-34b后對成肌細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因影響,結(jié)果表明miR-34b抑制成肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。2.利用生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報告載體實驗、RNA pull-down實驗和RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Prote... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 骨骼肌生長發(fā)育及調(diào)控
        1.1 骨骼肌的生長發(fā)育起源
        1.2 骨骼肌增殖和分化的調(diào)控過程
    2 非編碼RNA特征及其在肌肉生長發(fā)育過程中的功能
        2.1 非編碼RNA的分類
        2.2 MicroRNA
            2.2.1 MicroRNA的生物發(fā)生
            2.2.2 MicroRNA的作用機制
            2.2.3 MicroRNA在肌肉發(fā)育中的作用
            2.2.4 MiR-34 家族簡介
        2.3 長鏈非編碼RNA(lncRNA)
            2.3.1 LncRNA的基本特征
            2.3.2 LncRNA與肌肉的生長發(fā)育
        2.4 MicroRNA的研究方法
    3 本研究的目的與意義
第二章 材料與方法
    1 實驗材料
        1.1 細(xì)胞與動物
        1.2 菌株和載體
        1.3 主要試劑和試劑盒
        1.4 常用試劑及配制
        1.5 主要儀器和設(shè)備
        1.6 應(yīng)用的分析軟件和生物信息學(xué)網(wǎng)站
    2 試驗方法
        2.1 構(gòu)建小鼠組織表達(dá)譜
            2.1.1 小鼠組織樣總RNA提取
            2.1.2 RNA濃度和純度檢測
            2.1.3 RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA
            2.1.4 MiRNA莖環(huán)DNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            2.2.2 細(xì)胞凍存
            2.2.3 細(xì)胞的增殖培養(yǎng)
            2.2.4 細(xì)胞的分化培養(yǎng)
        2.3 MiR-34b抑制劑和模擬物的設(shè)計合成
        2.4 SYISL雙熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建
            2.4.1 SYISL cDNA的克隆
            2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳和成像
            2.4.3 PCR產(chǎn)物的回收和克隆測序
        2.5 pmirGLO-SYISL突變載體的構(gòu)建
        2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.6.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的微小RNA和超表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
            2.6.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的SYISL雙熒光載體細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光測定
        2.7 細(xì)胞總RNA提取和c DNA制備
        2.8 熒光定量PCR
            2.8.1 熒光定量PCR體系
            2.8.2 定量數(shù)據(jù)分析
            2.8.3 熒光定量PCR引物
        2.9 細(xì)胞和組織蛋白提取及濃度測定
        2.10 Western Blot實驗
            2.10.1 SDS-PAGE凝膠制備
            2.10.2 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.10.3 轉(zhuǎn)膜
            2.10.4 抗原抗體免疫反應(yīng)
            2.10.5 ECL化學(xué)發(fā)光檢測
        2.11 EdU染色
        2.12 免疫熒光分析
        2.13 RNA免疫沉淀(RIP)
            2.13.1 裂解產(chǎn)物的準(zhǔn)備
            2.13.2 磁珠的準(zhǔn)備
            2.13.3 RNA沉淀反應(yīng)
            2.13.4 RNA的純化
            2.13.5 cDNA的合成
        2.14 RNA pull-down實驗
            2.14.1 SYISL基因體外轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建
            2.14.2 SYISL基因體外轉(zhuǎn)錄
        2.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
第三章 結(jié)果與分析
    1 MiR-34b的組織表達(dá)譜
    2 MiR-34b在成肌細(xì)胞不同分化時期的表達(dá)情況
    3 MiR-34b對成肌細(xì)胞增殖的影響
        3.1 MiR-34b inhibitor對 miR-34b的抑制效率檢測
        3.2 抑制miR-34b對成肌細(xì)胞增殖的影響
        3.3 過表達(dá)miR-34b對成肌細(xì)胞增殖的影響
    4 MiR-34b對成肌細(xì)胞分化的影響
        4.1 抑制miR-34b對成肌細(xì)胞分化的影響
        4.2 過表達(dá)miR-34b對成肌分化的影響
    5 MiR-34b對 SYISL的影響
        5.1 生物信息學(xué)預(yù)測miR-34b可靶向SYISL
        5.2 SYISL雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建和鑒定
        5.3 在C2C12和Hela細(xì)胞中驗證miR-34b與 SYISL結(jié)合
        5.4 體外實驗驗證miR-34b可直接與SYISL和 AGO2 結(jié)合
        5.5 miR-34b下調(diào)SYISL的表達(dá)量
    6 MiR-34b通過靶向SYISL調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞增殖和分化
    7 MiR-34b促進(jìn)SYNPO2 的表達(dá)
第四章 討論
    1 MiR-34b靶向SYISL
    2 MiR-34b在成肌細(xì)胞增殖和分化過程中的功能
    3 MiR-34b通過靶向SYISL調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞增殖和分化
    4 MiR-34b對 SYNPO2 基因表達(dá)的影響
第五章 小結(jié)
    1 本研究主要結(jié)論
    2 主要創(chuàng)新點
    3 下一步計劃
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3643249