沙門菌是一種常見的人獸共患致病菌,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。流行病學研究表明,國內規(guī)模化養(yǎng)雞場沙門菌感染的優(yōu)勢血清型是腸炎沙門菌和雞白痢沙門菌。本實驗室前期建立的檢測D群沙門菌抗體的O9單抗競爭ELISA方法雖然可以快速、高效地檢測這兩種沙門菌感染,但無法進一步區(qū)分。研究表明,基于H抗原特異性抗體的檢測方法可以解決這一難題。因此,本研究在已有腸炎沙門菌H:g抗原單抗的基礎上,通過條件的優(yōu)化,建立了快速檢測腸炎沙門菌抗體的競爭ELISA方法。并且發(fā)現(xiàn),該方法與O9單抗競爭ELISA的聯(lián)合使用,可以有效鑒別區(qū)分雞白痢沙門菌的感染,為雞白痢沙門菌凈化提供技術支撐。1.沙門菌H:g抗原單抗競爭ELISA方法的建立以本實驗室制備的12E3雜交瘤細胞制備腹水單抗,經純化標記后,其效價為32000。同時,應用酸解法提取腸炎沙門菌鞭毛蛋白作為包被抗原。采用方陣滴定法確定競爭ELISA方法中抗原的最適包被濃度為5.8 μg/mL,酶標抗體的最適使用濃度為0.5 μg/mL。在此基礎上,確定待測血清的最適稀釋度為1:8。經過一系列實驗條件的優(yōu)化,確定檢測條件:以PBS作為抗原包被液,4℃包被20h;以含5... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
文獻綜述 家禽腸炎沙門菌研究進展
    1 流行病學
    2 致病性和感染機制
    3 SE檢測方法
        3.1 微生物學檢測方法
        3.2 免疫學檢測方法
        3.3 分子生物學檢測方法
    4 展望
第一章 沙門菌H:g抗原單克隆抗體競爭ELISA方法的建立
    1 材料
        1.1 菌株
        1.2 生物材料
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器和耗材
        1.5 實驗動物
    2 方法
        2.1 雜交瘤細胞的復蘇
        2.2 小鼠腹水的制備
        2.3 小鼠腹水的純化與標記
        2.4 腸炎沙門菌鞭毛蛋白的提取與純化
        2.5 最適抗原包被濃度與酶標抗體濃度的確定
        2.6 最適血清稀釋倍數(shù)的確定
        2.7 最適抗原包被液的確定
        2.8 最適包被條件的確定
        2.9 最適封閉液的確定
        2.10 最適封閉時間的確定
        2.11 酶標抗體最適孵育時間的確定
        2.12 最適顯色時間的確定
        2.13 最適抗原包被濃度和酶標抗體濃度的優(yōu)化
        2.14 H:g單抗競爭ELISA方法閾值的確定
        2.15 H:g單抗競爭ELISA方法檢測限的確定
        2.16 H:g單抗競爭ELISA方法的特異性和敏感性測定
        2.17 H:g單抗競爭ELISA方法的重復性測定
        2.18 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 單抗純化與標記結果
        3.2 鞭毛蛋白的提取分析結果
        3.3 最適抗原包被濃度與酶標抗體濃度的分析結果
        3.4 最適血清稀釋度的分析結果
        3.5 最適包被液分析結果
        3.6 最適包被條件分析結果
        3.7 最適封閉液分析結果
        3.8 最適封閉時間分析結果
        3.9 酶標抗體最適孵育時間分析結果
        3.10 最適顯色時間分析結果
        3.11 抗原包被濃度與酶標抗體稀釋度的優(yōu)化分析結果
        3.12 H:g單抗競爭ELISA閾值分析結果
        3.13 H:g單抗競爭ELISA檢測限分析結果
        3.14 H:g單抗競爭ELISA的特異性和敏感性測定結果
        3.15 重復性實驗分析結果
    4 討論
第二章 沙門菌H:g單抗競爭ELISA試劑盒的組裝與應用
    1 材料
        1.1 生物材料
        1.2 被檢樣品
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器和耗材
        1.5 實驗動物
    2 方法
        2.1 酶標抗體保護劑的選擇
        2.2 熱穩(wěn)定性實驗
        2.3 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的組裝
        2.4 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的保存穩(wěn)定性實驗
        2.5 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的質量檢驗
        2.6 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的單盲檢測實驗
        2.7 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的適用性實驗
        2.8 H:g單抗競爭ELISA試劑盒在檢測養(yǎng)殖場臨床樣品中的應用
        2.9 H:g單抗競爭ELISA試劑盒與O9單抗競爭ELISA試劑盒的聯(lián)用
        2.10 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 保護劑保護效果的分析結果
        3.2 包被有鞭毛蛋白的固相載體的熱穩(wěn)定性分析結果
        3.3 酶標抗體的熱穩(wěn)定性分析結果
        3.4 陰、陽性對照和空白對照血清的熱穩(wěn)定性分析結果
        3.5 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的組裝結果
        3.6 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的穩(wěn)定性分析結果
        3.7 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的質量檢驗結果
        3.8 H:g單抗競爭ELISA試劑盒的單盲檢測結果
        3.9 H:g單抗競爭ELISA試劑盒與商品化試劑盒的比較結果
        3.10 H:g單抗競爭ELISA與PAT的比較結果
        3.11 不同養(yǎng)殖場臨床樣品的檢測結果
        3.12 養(yǎng)殖場不同月份臨床樣品的檢測結果
        3.13 H:g單抗競爭ELISA試劑盒與O9單抗競爭ELISA試劑盒的聯(lián)用結果
    4 討論
全文總結
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]新楊黑與蘇禽綠殼蛋雞雞白痢的檢測與凈化研究[J]. 蔡丙嚴,田其真,郝福星,張玲,戴建華.  畜禽業(yè). 2019(08)
[2]食品中沙門氏菌檢測現(xiàn)狀分析[J]. 李惠靜.  現(xiàn)代食品. 2019(09)
[3]雙抗原夾心ELISA法檢測抗念珠菌烯醇化酶抗體[J]. 汪俊,吳福珍,焦繼光.  海南醫(yī)學. 2018(13)
[4]我國部分地區(qū)雞、豬源沙門氏菌血清型與耐藥性比較[J]. 李月華,趙建梅,張青青,曲志娜.  中國動物檢疫. 2018(06)
[5]中國四省份規(guī)�；怆u生產全過程沙門菌的污染狀況和耐藥特征研究[J]. 李薇薇,白莉,張秀麗,遇曉杰,唐震,畢振旺,郭云昌.  中華預防醫(yī)學雜志. 2018 (04)
[6]種雞場沙門菌血清學與病原學監(jiān)測結果比較與分析[J]. 劉洋,王傳彬,霍斯琪,劉玉良,張倩,顧小雪.  中國獸醫(yī)雜志. 2018(02)
[7]雞白痢沙門氏菌膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制及初步應用[J]. 劉志科,楊寧寧,徐明國,荊明龍,曹旭東,陳創(chuàng)夫.  河南科技學院學報(自然科學版). 2018(01)
[8]食源性沙門菌PCR檢測方法的建立[J]. 劉緒平,李景蓮,熊駿,姜鵬超,蔣雙勤,劉衛(wèi)德.  中國衛(wèi)生檢驗雜志. 2017(24)
[9]乳粉中金黃色葡萄球菌與沙門氏菌定性檢測能力驗證結果與分析[J]. 葉玉華.  食品安全導刊. 2017(30)
[10]腸炎沙門菌感染ICR小鼠模型的建立[J]. 王偉,尹海暢,呂興峰,劉思國,陳洪巖,孟慶文.  中國獸醫(yī)科學. 2017(10)

碩士論文
[1]沙門菌O9抗原單克隆抗體競爭ELISA試劑盒的研制及初步應用[D]. 耿浩鵬.揚州大學 2018
[2]雞白痢/雞傷寒診斷方法的建立與初步應用[D]. 許瑩.揚州大學 2018
[3]我國部分地區(qū)種雞場沙門菌流行現(xiàn)狀調查、耐藥性分析及分子分型[D]. 費曉.揚州大學 2017
[4]江蘇地區(qū)禽源沙門菌的臨床檢測及相關特性的分析[D]. 趙方.揚州大學 2016
[5]水溶性多色量子點的合成及其作為納米熒光探針在蛋品安全檢測方面的應用研究[D]. 王蓓蓓.華中農業(yè)大學 2014
[6]一株雞源性腸炎沙門氏菌MLST分型及三型分泌系統(tǒng)基因分析[D]. 王濤.山東農業(yè)大學 2012
[7]小反芻獸疫間接ELISA檢測方法的優(yōu)化及其應用[D]. 陸則基.揚州大學 2009



本文編號：3643157