溶酶體α-甘露糖苷酶（α-mannosidase, AMA）屬于糖苷水解酶家族38家族,主要參與N-連接糖蛋白的生物合成及加工折疊過程。瘋草是一種主要的有毒植物,含有毒素苦馬豆素（swainsonine, SW）,其毒性是SW能夠抑制溶酶體AMA,機(jī)體低聚糖的新陳代謝發(fā)生異常后會大量蓄積在細(xì)胞內(nèi),從而使細(xì)胞發(fā)生空泡變性,并由此導(dǎo)致動物中毒死亡,目前還沒有徹底治愈瘋草中毒的方法�？紫檠诺瓤寺　⒈磉_(dá)了山羊溶酶體AMA（chLAM）,應(yīng)用生物信息學(xué)對接分析,確定了降低山羊溶酶體AMA對SW敏感性的定點(diǎn)突變位點(diǎn)。本試驗(yàn),通過重疊延伸PCR法對山羊溶酶體AMA進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建野生型及突變型酵母重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)野生型及突變型chLAM重組蛋白,對比突變前后的酶活特性,純化對SW敏感性降低的表達(dá)產(chǎn)物,為預(yù)防和治療家畜瘋草中毒,生產(chǎn)瘋草中毒的解毒劑提供依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果如下：1.根據(jù)GenBank中提交的山羊LAM序列（JN602369）設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物,應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)對山羊溶酶體α-甘露糖苷酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,突變位點(diǎn)為A28Trp→Gly和D58Tyr→Gly位點(diǎn),獲得了具有突變序列的全長... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

野生型和突變型C/JLAM基因PCR產(chǎn)物電泳圖

物使用目的片段的下游引物His-cMAM R (表2-1 )，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見有明顯能擴(kuò)增出目的條帶的陽性重組菌落（圖3-1，7和9)，圖中共顯示9個菌落，Ml 2345 6 7 8 9250—100—圖3-1菌落PCR蹄選陽性重組表達(dá)菌1-6.8.假陽性菌落，7.pPIC9K-dAM重組陽性菌落，9.pPIC9K-c/7LAM-A28-D58重組陽性菌落Fig 3-1 Colony PCR to select positive recombinant plasmid1-6.8. false positive bacterium colony identified by PCR, 7. positive recombinant bacterium colony ofpPIC9K-c7?LAM, 9. positive recombinant bacterium colony of pPIC9K-c7?LAM-A28-D58

(含有Amp終濃度為100 [ig/mD中，37°C過夜培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒后取20 ^iL送測序，取2^11^進(jìn)行￡0)111單酶切鑒定，結(jié)果如圖3-2，1和2分別代表野生型重組質(zhì)粒和突變型重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果顯示兩條清晰的條帶，即PPIC9K載體條帶（圖3-2, a),和目的片段條帶（圖3-2，b)o綜合菌落PCR結(jié)果，測序結(jié)果及EcoRI單酶切結(jié)果可以判定野生型和突變型畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。M 1 2m10000— 7000—4000—L^~D2000—1000—250—圖3-2重組表達(dá)質(zhì)粒EcoR I單酶切電泳M. 10000 DNA Marker; I.野生型重組表達(dá)質(zhì)粒，2.突變型重組表達(dá)質(zhì)粒；a.pPIC9K載體片段，b.目的基因片段Fig 3-2 Positive recombinant expression plasmid digested by EcoR IM. 1000 DNA Marker; 1. Wild-type recombinant expression plasmid，2. Mutant-type recombinantexpression plasmid; a. length of vector pPIC9K, b. length of target gene3.3.2重組酵母菌株基因組PCR使用C/jLAM基因的的特異性引物或5’-A0X和3’-AOX通用引物分別以空載pPIC9K重組菌基因組DNA、野生型pPIC9K:-c/2LAM重組菌基因組DNA和突變型pPIC9K-c/zLAM-A28-D58重組菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢菌。每個樣挑取7個菌落

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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