鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎,是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）引起的、危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種細(xì)菌性傳染病。目前已有4株RA的全基因組序列在GenBank上公布。RA基因組編碼基因約有2000個,但其中僅有少數(shù)基因功能已知。構(gòu)建大規(guī)模的隨機突變庫,是研究RA基因功能的一種重要手段。本研究以鴨疫里默氏桿菌Yb2株為受體菌、攜帶有質(zhì)粒pEP4351的大腸桿菌BW19851為供體菌,通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將質(zhì)粒pEP4351導(dǎo)入Yb2株中,然后轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機插入Yb2株的基因組中；再利用Tn4351上的紅霉素抗性基因進行陽性接合子的篩選,構(gòu)建了一個包含約3100個突變株的隨機突變文庫。計算得轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為7.1×10-6。通過接種雛鴨的感染實驗對突變株進行了篩選,初篩共獲得69株毒力減弱的突變株。利用反向PCR等技術(shù)對轉(zhuǎn)座子插入位點的序列進行了測定,獲得了27株突變株的轉(zhuǎn)座子插入位點。使用Southern blot對轉(zhuǎn)座子Tn4351插入突變株基因組的次數(shù)進行檢測,以確定突變株毒力減弱是由于單一的插入突變導(dǎo)致的。在復(fù)核過的突變株中,選取了毒力減弱水... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略表
文獻綜述
    1. 鴨疫里默氏桿菌研究進展
        1.1 病原概述
        1.2 血清型
        1.3 抗生素耐藥性
        1.4 毒力因子研究進展
            1.4.1 外膜蛋白A(OmpA)
            1.4.2 TonB依賴受體1(TonB-dependent receptor 1,TbdR1)
            1.4.3 鐵載體相互作用蛋白(SIP)
            1.4.4 明膠酶
            1.4.5 其他潛在的毒力相關(guān)因子
    2 轉(zhuǎn)座子誘變
        2.1 轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)簡介
        2.2 轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)的應(yīng)用
        2.3 信號標(biāo)簽誘變(STM)技術(shù)
    3 小結(jié)
1 引言
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 抗生素
        2.1.5 酶
        2.1.6 其他試劑、試劑盒及感受態(tài)
        2.1.7 引物
        2.1.8 主要儀器
    2.2 鴨疫里默氏桿菌Yb2株轉(zhuǎn)座子隨機突變庫的構(gòu)建
        2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)
        2.2.2 鴨疫里默氏桿菌Yb2株半數(shù)致死量(LD_(50))的測定
        2.2.3 卡那霉素和紅霉素對鴨疫里默氏桿菌Yb2株最小抑菌濃度的測定
        2.2.4 接合轉(zhuǎn)導(dǎo)
        2.2.5 雙重PCR鑒定轉(zhuǎn)座子插入陽性突變株
        2.2.6 突變庫的保存
    2.3 毒力減弱突變株的篩選
        2.3.1 初篩
        2.3.2 復(fù)核
    2.4 毒力減弱突變株轉(zhuǎn)座子插入位點鑒定
        2.4.1 突變株基因組的提取
        2.4.2 突變株基因組的酶切
        2.4.3 乙醇沉淀法提純酶切產(chǎn)物
        2.4.4 酶切產(chǎn)物的自連
        2.4.5 反向PCR擴增
        2.4.6 轉(zhuǎn)座子插入位點分析
        2.4.7 Southern blot分析轉(zhuǎn)座子的插入次數(shù)
    2.5 突變株Y2666插入失活基因的功能驗證
        2.5.1 突變株Y2666基因互補株的構(gòu)建
        2.5.2 突變株Y2666與基因互補株cY2666的生物學(xué)特性
3. 結(jié)果
    3.1 鴨疫里默氏桿菌Yb2株的半數(shù)致死量
    3.2 卡那霉素和紅霉素對鴨疫里默氏桿菌Yb2株最小抑菌濃度的測定
    3.3 隨機突變株的鑒定
        3.3.1 雙抗培養(yǎng)基篩選
        3.3.2 PCR鑒定
        3.3.3 接合轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的計算
    3.4 毒力減弱突變株動物實驗篩選結(jié)果
        3.4.1 初篩結(jié)果
        3.4.2 復(fù)核結(jié)果
    3.5 毒力減弱突變株轉(zhuǎn)座子插入位點鑒定
        3.5.1 反向PCR結(jié)果
        3.5.2 插入位點序列分析結(jié)果
    3.6 Southern Blot結(jié)果
        3.6.1 突變株基因組酶切
        3.6.2 Southern Blot
    3.7 突變株Y2666基因互補株的構(gòu)建
        3.7.1 突變株Y2666轉(zhuǎn)座子插入位點分析
        3.7.2 突變株Y2666基因互補株的構(gòu)建
    3.8 突變株Y2666與基因互補株cY2666的生物學(xué)特性
        3.8.1 菌落形態(tài)與鏡檢觀察
        3.8.2 血清凝集試驗
        3.8.3 生長曲線的繪制
        3.8.4 半數(shù)致死量測定
        3.8.5 菌血計數(shù)結(jié)果
4 討論
    4.1 突變體庫親本株的選擇
    4.2 供體菌和受體菌的培養(yǎng)
    4.3 供體菌和受體菌的數(shù)量比例
    4.4 轉(zhuǎn)座子突變體庫的保存與復(fù)蘇
    4.5 篩選毒力減弱突變株的菌量
    4.6 轉(zhuǎn)座子隨機突變庫的利用潛力
結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3642158