山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）呼吸道病毒屬（Respirovirus）中的一員,為有囊膜的單股負鏈RNA病毒。該病毒能通過氣溶膠進行水平傳播,相鄰健康羊只感染后出現(xiàn)與患羊相同的咳嗽、體溫升高、流鼻涕、精神沉郁等臨床癥狀。感染羊只可通過多種途徑向外排毒,嚴重感染時可在血液中檢出病毒,這為該病的防控增加了難度。研究證實,宿主細胞微小核糖核酸（Micro-ribonucleic acid,miRNA）是宿主-病原體相互作用的復雜網(wǎng)絡中不可或缺的調(diào)節(jié)因子,miRNA通過間接作用于某個細胞成分影響細胞內(nèi)通路和調(diào)節(jié)先天性免疫應答,在抗病毒感染和復制方面扮演了重要角色。在前期研究中,將CPIV3接種牛腎細胞（Madin-darby bovine kidney cells,MDBK）后,通過高通量測序技術獲得了249個差異表達的miRNA,其中bta-miR-98與bta-miR-222在感染組中下調(diào)。GO注釋與KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),bta-miR-222在抗病毒方面與先天性免疫中有重... 

【文章來源】：貴州大學貴州省211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
文獻綜述
    綜述一 副流感病毒3型病原學及其檢測方法研究進展
        1. PIV3病原學研究進展
            1.1 PIV3基因組
            1.2 PIV3結構蛋白
            1.3 PIV3基因組復制
        2. PIV3檢測方法研究進展
            2.1 PIV3病原學檢測
            2.2 PIV3血清學檢測
    綜述二 MiRNA研究進展
        1. MiRNA的發(fā)現(xiàn)與定義
        2. MiRNA識別及靶基因預測
        3. 細胞內(nèi)源miRNA與副黏病毒相互作用
            3.1 細胞內(nèi)源miRNA影響副黏病毒免疫反應
            3.2 細胞內(nèi)源miRNA影響細胞分裂與細胞凋亡
            3.3 細胞內(nèi)源miRNA影響腫瘤生成
            3.4 細胞內(nèi)源miRNA對副黏病毒的其他功能
        4. MiRNA與CPIV3
        5. 本研究的目的及意義
試驗研究
    第一章 細胞內(nèi)bta-miR-222 靶向IRF2抑制CPIV3復制的分子機制
        1. 材料
            1.1 細胞與病毒
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 Bta-miR-222 mimics和bta-miR-222 inhibitor的設計與合成
            2.2 Bta-miR-222 對CPIV3復制的影響
                2.2.1 熒光定量PCR
                2.2.2 病毒多步生長曲線
            2.3 Bta-miR-222 調(diào)控CPIV3復制的分子機制
                2.3.1 Bta-miR-222 對IFN產(chǎn)生的影響
                2.3.2 Bta-miR-222 靶基因預測
                2.3.3 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析bta-miR-222 靶基因
                2.3.4 熒光定量PCR分析bta-miR-222 靶基因
                2.3.5 Western blot分析bta-miR-222 靶基因蛋白表達水平
                2.3.6 IRF2基因敲除對CPIV3復制的影響
                2.3.7 統(tǒng)計分析
        3. 結果
            3.1 Bta-miR-222 對CPIV3復制的影響
            3.2 Bta-miR-222 對Ⅰ型干擾素表達的影響
            3.3 Bta-miR-222 的靶基因預測
            3.4 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析bta-miR-222 靶基因
                3.4.1 雙熒光素酶報告載體的構建與鑒定
                3.4.2 Bta-miR-222 對IRF2的調(diào)控作用
            3.5 敲除IRF2基因?qū)PIV3復制的影響
        4. 討論
    第二章 細胞內(nèi)bta-miR-98 靶向Caspase 3 抑制CPIV3復制的分子機制
        1. 材料
            1.1 細胞與病毒
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 CPIV3誘導細胞凋亡的檢測
                2.1.0 熒光定量PCR
                2.1.1 Caspase 3/8/9 酶活性檢測
                2.1.2 流式細胞術
            2.2 Bta-miR-98 調(diào)控細胞凋亡影響CPIV3復制
                2.2.1 Bta-miR-98 mimics和bta-miR-98 inhibitor的設計與合成
                2.2.2 Bta-miR-98 對CPIV3復制的影響
            2.3 Bta-MiR-98 調(diào)控細胞凋亡影響CPIV3復制
                2.3.1 Caspase 3 酶活性檢測
                2.3.2 流式細胞術
            2.4 Bta-miR-98 調(diào)控CPIV3復制的分子機制
                2.4.1 Bta-miR-98 對Caspase 3 產(chǎn)生的影響
                2.4.2 Bta-miR-98 靶基因預測
                2.4.3 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析bta-miR-98 靶基因
                2.4.4 Caspase 3 基因敲除對CPIV3復制的影響
            2.5 統(tǒng)計分析
        3. 結果
            3.1 CPIV3促進MDBK細胞凋亡
            3.2 Bta-MiR-98 對CPIV3復制的影響
            3.3 Bta-miR-98 靶基因的預測
            3.4 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析bta-miR-98 靶基因
                3.4.1 雙熒光素酶報告載體的構建與鑒定
                3.4.2 Bta-miR-98 對Caspase 3 的調(diào)控作用
            3.5 Caspase 3 基因敲除對CPIV3復制的影響
        4. 討論
    第三章 慢病毒介導的bta-miR-222 穩(wěn)定過表達MDBK細胞株的構建及鑒定
        1. 材料
            1.1 細胞與病毒
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 引物的設計與合成
            2.2 Pri-bta-miR-222 與GFP基因片段的擴增
            2.3 重組PCDH-miR222GFP質(zhì)粒的構建與鑒定
            2.4 慢病毒V_(PCDH+miR-222)的包裝
            2.5 V_(PCDH+miR-222)感染MDBK細胞
            2.6 熒光定量PCR
                2.6.1 細胞miRNA的分離提取與反轉錄
                2.6.2 熒光定量PCR
        3. 結果
            3.1 重組慢病毒表達質(zhì)粒的構建與鑒定
            3.3 重組慢病毒的制備
            3.4 穩(wěn)定表達bta-miR-222 的MDBK細胞株的建立
            3.5 熒光定量PCR
        4. 討論
全文結論
參考文獻
致謝
附錄
碩士研究生期間發(fā)表論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Paramyxovirus evasion of innate immunity: Diverse strategies for common targets[J]. Michelle D Audsley,Gregory W Moseley.  World Journal of Virology. 2013(02)
[2]麻疹病毒滬191對HeLa腫瘤細胞抑制作用的體內(nèi)外實驗研究[J]. 嚴銀芳,楊小清.  微生物學雜志. 2012(04)
[3]動物副黏病毒感染與對策思考[J]. 顧萬軍,黃良宗.  廣東畜牧獸醫(yī)科技. 2010(06)
[4]副粘病毒F蛋白HR1和HR2在特異性膜融合中的作用[J]. 任桂杰,王志玉,李士保,王桂亭,宋艷艷,許洪芝,溫紅玲.  中華微生物學和免疫學雜志. 2005(10)
[5]The Role of TNF Related Apoptosis-Inducing Ligand in Neurodegenerative Diseases[J]. Y.Huang~(1,2) N.Erdmann~(1,2) H.Peng~(1,2) Y.Zhao~(4,5) Jialin Zheng~(1,2,3,6) ~1The laboratory of Neurotoxicology at the Center for Neurovirology & Neurodegenerative Disorders,~2Dept.Pharmacology,~3Dept.of Pathology and Microbiology,~4Dept.of Surgery,University of Nebraska Medical Center,Omaha,NE 68198-5880,USA;~5Institute of Animal Research,Chinese Academy of Science,China;.  Cellular & Molecular Immunology. 2005(02)
[6]膜融合脂質(zhì)體為載體的黑色素瘤疫苗的研究[J]. 李強,金一,崔福德.  中國藥學雜志. 2003(11)
[7]一種新的病毒病—尼帕病毒腦炎[J]. 黃元桐.  山西醫(yī)藥雜志. 2000(02)
[8]干擾素抗體與干擾素治療[J]. 孔麗,劉金星,曹治宸,李兵順.  河北醫(yī)科大學學報. 1998(05)

碩士論文
[1]牛副流感病毒3型C和V蛋白通過負調(diào)控IRF7拮抗Ⅰ型干擾素表達的研究[D]. 劉瑩.東北農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]二氯乙酸協(xié)同低劑量溶瘤麻疹病毒治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤[D]. 李春妍.南京大學 2013
[3]miR-15a對流感病毒誘導細胞凋亡機制研究[D]. 張菁.湖南農(nóng)業(yè)大學 2011



本文編號：3642023