發(fā)布時間：2022-02-22 19:20

　　內(nèi)蒙古白絨山羊是優(yōu)秀的絨山羊品種,產(chǎn)出高品質(zhì)羊絨,在全球享有盛譽。提高羊絨產(chǎn)量一直是絨山羊品種選育的重要任務(wù),分子育種為品種改良提供了新手段。RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的基因定點編輯技術(shù),它通過一段短的RNA序列與DNA靶序列通過堿基互補原則形成雙鏈,后結(jié)合Cas9蛋白在DNA靶位點誘導(dǎo)形成雙鏈斷裂損傷（double-stranded break,DSBs）,DSBs修復(fù)時可以在基因組靶位點引入特殊的基因突變,具有設(shè)計簡單,打靶效率高及能在靶位點形成多種突變的優(yōu)點。成纖維細(xì)胞生長因子5（fibroblast growth factor 5,FGF5）是影響毛囊周期性活動及絨毛生長的重要生長因子,是一個已知的最強有力的控制毛囊從生長期向休止期轉(zhuǎn)化的因子。敲除FGF5基因可以解除對毛囊生長周期的控制,促進絨毛生長。本文針對內(nèi)蒙古白絨山羊FGF5基因設(shè)計了特異性的“向?qū)NA”分子（Single guide RNA, sgRNA）,并對該sgRNA的潛在脫靶位點進行預(yù)測,構(gòu)建特異于內(nèi)蒙古白絨山羊FGF5基因的CRISPR/Cas9表達載體,轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)211工程院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 CRISPR/Cas基因組定點編輯技術(shù)的建立
        1.1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與分類
        1.1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機制
        1.1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展及成熟
    1.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用
        1.2.1 在基因敲除中的應(yīng)用
        1.2.2 在基因定點整合中的應(yīng)用
        1.2.3 在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的應(yīng)用
        1.2.4 CRISPR/Cas9技術(shù)相比其他基因編輯技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢
    1.3 CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)及改進措施的研究
    1.4 結(jié)語
        參考文獻
第二章 CRISPR/Cas9表達載體的構(gòu)建
    2.1 材料
        2.1.1 主要儀器設(shè)備
        2.1.2 化學(xué)試劑與耗材
        2.1.3 實驗材料
    2.2 方法
        2.2.1 靶位點的選取及gRNA的設(shè)計
        2.2.2 潛在脫靶位點的確定
        2.2.3 CRISPR/Cas9骨架載體的構(gòu)建
        2.2.4 靶位點基因PCR引物設(shè)計及反應(yīng)條件優(yōu)化
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 靶位點的選取與sgRNA的確定
        2.3.2 脫靶位點的確定
        2.3.3 CRISPR/Cas9骨架載體的構(gòu)建及測序驗證
        2.3.4 靶位點基因PCR引物設(shè)計及條件優(yōu)化
    2.4 討論
第三章 定點敲除FGF5基因的內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞系篩選及脫靶位點的驗證
    3.1 材料
        3.1.1 主要儀器設(shè)備
        3.1.2 化學(xué)試劑與耗材
        3.1.3 實驗材料
    3.2 方法
        3.2.1 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)化
        3.2.2 CRISPR/Cas9表達載體轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞
        3.2.3 SURVEYOR酶切活性驗證及體系的優(yōu)化
        3.2.4 Surveyor酶切驗證轉(zhuǎn)染后的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞系pool克隆
        3.2.5 測序驗證轉(zhuǎn)染后的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞系pool克隆
        3.2.6 FGF5基因敲除突變單克隆的獲得
        3.2.7 FGF5基因敲除單克隆測序驗證
        3.2.8 脫靶位點的驗證
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
        3.3.2 SURVEYOR酶切活性驗證及體系的優(yōu)化
        3.3.3 轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9特異性表達載體后pool克隆Surveyor酶切驗證
        3.3.4 轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9特異性表達載體后pool克隆測序驗證
        3.3.5 敲除FGF5基因絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞陽性單克隆細(xì)胞系的獲得及鑒定
        3.3.6 潛在脫靶位點的驗證
    3.4 討論
結(jié)論
攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號：3640072