發(fā)布時(shí)間：2022-02-21 12:51

　　噬菌體展示技術(shù)是單克隆抗體篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一，在抗體篩選領(lǐng)域中的應(yīng)用占有越來(lái)越大的比例。CD46又稱輔膜蛋白，是廣泛存在于有核細(xì)胞表面的一種受體，在哺乳動(dòng)物中相對(duì)保守，并在先天免疫的補(bǔ)體的激活和調(diào)節(jié)的經(jīng)典途徑和替代途徑中起著關(guān)鍵作用，除此之外CD46還是一些病毒和細(xì)菌的細(xì)胞受體。本研究充分利用哺乳動(dòng)物保守蛋白在禽源免疫系統(tǒng)中具有更高的免疫原性，結(jié)合禽源抗體可變區(qū)基因更易克隆擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)，采用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建抗豬源CD46的單鏈抗體庫(kù)，并從中篩選出特異性抗CD46的scFv，為高親和力、高特異性禽源單克隆抗體的制備提供技術(shù)支撐。本研究采用DNA和蛋白復(fù)合免疫的方式免疫SPF公雞，先用真核表達(dá)載體pcDNA-CD46和pCAGG-CD46免疫，然后用原核表達(dá)的CD46-His融合蛋白為免疫原。監(jiān)測(cè)血清效價(jià)，經(jīng)4次免疫，分離脾臟B淋巴細(xì)胞，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的引物分別擴(kuò)增VH和VL基因，經(jīng)重疊PCR大量擴(kuò)增scFv。選取Sfi I和Not I為酶切位點(diǎn)，酶切消化scFv和pCANTAB5E后，用T4DNA連接酶，將scFv基因連接入pCANTAB5E噬菌粒載體，并將... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 噬菌體展示抗體技術(shù)研究進(jìn)展
        1.1.1 噬菌體展示基本形式
        1.1.2 噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)的改進(jìn)
        1.1.3 噬菌體展示技術(shù)的最新應(yīng)用
    1.2 雞 IgY 抗體簡(jiǎn)介
    1.3 CD46 研究進(jìn)展
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 噬菌體展示抗體庫(kù)的構(gòu)建和特異性抗體的篩選
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.1.5 主要培養(yǎng)基的配置
    2.2 方法
        2.2.1 CD46-His 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.2 融合蛋白的 Western blot 分析
        2.2.3 pET-30a-CD46/BL21 菌體的處理
        2.2.4 CD46-His 融合蛋白的純化
        2.2.5 包涵體蛋白復(fù)性
        2.2.6 pMal-c2x-CD46 載體的構(gòu)建
        2.2.7 CD46-MBP 融合蛋白的表達(dá)純化
        2.2.8 Western Blot 分析
        2.2.9 SPF 雞的免疫
        2.2.10 scFv 抗體庫(kù)的構(gòu)建
        2.2.11 抗體庫(kù)的多樣性鑒定
        2.2.12 特異性抗體的淘選
        2.2.13 Phage ELISA 篩選高特異性 scFv
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 免疫原的特性
        2.3.2 免疫后血清的特異性
        2.3.3 抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增
        2.3.4 抗體庫(kù)的構(gòu)建
        2.3.5 噬菌體抗體庫(kù)的多樣性
        2.3.6 抗體庫(kù)的淘選
    2.4 討論
        2.4.1 抗原的原核表達(dá)
        2.4.2 抗體庫(kù)的構(gòu)建
        2.4.3 抗體庫(kù)的淘選效率
        2.4.4 特異性 phage-scFv 的篩選
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3637288