柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）是分布最廣、致病力最強的幾種球蟲之一,嚴重危害養(yǎng)禽業(yè),造成重大的經(jīng)濟損失。目前藥物防治是控制球蟲病的有效手段,但隨著抗球蟲株的產(chǎn)生及綠色食品概念的形成,抗球蟲新型疫苗的研究成為熱點。E.tenella SAG13表面抗原蛋白是基于DF-1細胞感染模型,通過分泌蛋白質(zhì)組分析篩選到的一種上調(diào)表達蛋白。為探究EtSAG13是否具有分泌特性,以及是否可以作為候選疫苗抗原蛋白,本研究對EtSAG13基因進行原核表達,以E.tenella子孢子cDNA為模板進行擴增,按照GenBank的基因序列合成引物,將合成的EtSAG13基因序列連接到pET28a（+）載體上,構建了pET28a-SAG13重組質(zhì)粒,并將pET28a-SAG13重組質(zhì)粒轉化至大腸桿菌BL21中,利用IPTG誘導EtSAG13目的基因的表達;用SDS-PAGE及免疫印跡法對表達蛋白進行分析和鑒定。將EtSAG13表達的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,制備鼠源多克隆抗體,進行亞細胞定位,EtSAG13定位在E.tenella子孢子的表面,同時部分蛋白可以分泌到裂殖子細胞外,具有分泌特性。本研究將p... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
Abstract
前言
    1.1 雞球蟲病概述
    1.2 雞球蟲研究進展
        1.2.1 雞球蟲分子生物學研究進展
        1.2.2 雞球蟲分泌蛋白研究概況
            1.2.2.1 微線蛋白
            1.2.2.2 蛋白激酶
            1.2.2.3 棒狀體蛋白
    1.3 雞球蟲病防治概況
        1.3.1 藥物防治
        1.3.2 疫苗研究進展
            1.3.2.1 雞球蟲免疫機制
            1.3.2.2 傳統(tǒng)疫苗和商品化疫苗
            1.3.2.3 新型疫苗研究進展
        1.3.3 雞球蟲免疫應答的研究進展
    1.4 EtSAGs家族蛋白
    1.5 本研究的目的和意義
2.材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗菌株和載體
        2.1.2 試驗動物與蟲株
        2.1.3 主要試劑及試劑盒
        2.1.4 主要儀器設備
        2.1.5 溶液配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 引物設計與合成
        2.2.2 雞球蟲復壯與傳代
        2.2.3 雞球蟲的收集與孢子化卵囊的收集
        2.2.4 EtSAG13 基因的克隆與原核表達載體的構建
            2.2.4.1 EtSAG13 基因克隆與轉化
            2.2.4.2 EtSAG13 基因片段PCR產(chǎn)物的回收
            2.2.4.3 EtSAG13 目的基因片段和載體雙酶切和膠回收
            2.2.4.4 目的基因酶切產(chǎn)物與pET-28a(+)載體的連接
            2.2.4.5 重組質(zhì)粒轉化入Top10 感受態(tài)細胞
            2.2.4.6 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定
            2.2.4.7 重組質(zhì)粒DNA的提取與鑒定
            2.2.4.8 陽性克隆質(zhì)粒測序鑒定
        2.2.5 EtSAG13 重組蛋白的表達和純化
            2.2.5.1 EtSAG13 重組蛋白的原核表達
            2.2.5.2 EtSAG13 重組蛋白SDS-PAGE和 Western blot檢測
            2.2.5.3 重組EtSAG13 蛋白純化
        2.2.6 EtSAG13 鼠源多克隆抗體的制備及分泌蛋白鑒定
            2.2.6.1 EtSAG13 鼠源多克隆抗體的制備
            2.2.6.2 EtSAG13 的亞細胞定位分泌蛋白鑒定
        2.2.7 SAG13 蛋白免疫保護效果評價
            2.2.7.1 動物試驗設計與免疫程序
            2.2.7.2 EtSAG13 亞單位疫苗免疫保護效果評價
                2.2.7.2.1 存活率
                2.2.7.2.2 增重效果
                2.2.7.2.3 卵囊排出量
                2.2.7.2.4 盲腸病變計分
                2.2.7.2.5 抗球蟲指數(shù)(ACI)評價
                2.2.7.2.6 血清和粘膜抗體檢測
                2.2.7.2.7 細胞免疫水平的檢測
                2.2.7.2.8 統(tǒng)計分析
3 結果
    3.1 SAG13 基因的克隆與原核表達載體的構建
    3.2 EtSAG13 重組克隆載體的測序結果
    3.3 EtSAG13 多克隆抗體的制備及鑒定結果
        3.3.1 SDS-PAGE與 Western Blot驗證EtSAG13 蛋白的原核表達
        3.3.2 EtSAG13 原核重組蛋白的大量誘導及純化
        3.3.3 鼠源多克隆抗體的制備及分泌蛋白鑒定結果
        3.3.4 E.tenella蟲體EtSAG13 蛋白間接免疫熒光定位結果
    3.4 EtSAG13 亞單位疫苗免疫保護效果的評價
        3.4.1 體重增長情況
        3.4.2 盲腸病變計分
        3.4.3 卵囊排出量
        3.4.4 抗球蟲指數(shù)(ACI)結果
        3.4.5 血清抗體水平檢測結果
        3.4.6 粘膜抗體水平檢測結果
        3.4.7 CD4~+、CD8~+T 淋巴細胞亞群檢測結果
4 討論
    4.1 EtSAG13 重組蛋白分泌蛋白鑒定
    4.2 原核表達EtSAG13 蛋白的意義及其免疫保護效果
    4.3 血液抗體和粘膜抗體以及T淋巴細胞在抗球蟲感染免疫保護中的作用
5 結論
參考文獻
附錄
致謝
論文發(fā)表情況


【參考文獻】：
期刊論文
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[10]雞柔嫩艾美耳球蟲RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆與原核表達[D]. 許李麗.西南大學 2013



本文編號：3637131