大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（E.coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB）能夠與黏膜上皮細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1受體結(jié)合,具有很強(qiáng)的免疫原性和免疫增強(qiáng)活性,是目前最受關(guān)注的黏膜免疫佐劑之一。在其從實驗室走向產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的過程中,重組LTB蛋白獲得高效表達(dá)和通過生物安全性評價是其關(guān)鍵研發(fā)環(huán)節(jié)。本研究利用自動發(fā)酵罐培養(yǎng)重組畢赤酵母進(jìn)行LTB表達(dá)。培養(yǎng)條件為溫度30℃,pH 6.0,溶氧35%,氨水和2%蛋白胨為氮源,補(bǔ)入發(fā)酵液總體積1%的甲醇作為碳源。初始碳源消耗完后依據(jù)溶氧曲線的波動逐步增加甲醇的流加速度,使甲醇濃度維持在1.5%左右,誘導(dǎo)表達(dá)96 h,獲得重組LTB的高效分泌表達(dá)。以硫酸銨沉淀和Ni2+螯合柱親和層析等蛋白純化方法,獲得純度高達(dá)98%的重組LTB蛋白。以變性和非變性十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）驗證了重組LTB的五聚體結(jié)構(gòu)；神經(jīng)節(jié)苷脂GM1酶聯(lián)免疫吸附（GM.1-ELISA）法檢測結(jié)果表明,重組LTB具有與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合的生物活性。采用GM1-ELISA測定LTB注射后不同時間點鴨血清中的LTB含... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
上篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的研究進(jìn)展
        1 LTB的結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)特性
        2 LTB的表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展
        3 LTB的免疫原性研究
        4 LTB的免疫應(yīng)答及應(yīng)用
        5 LTB的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制
        6 LTB的佐劑作用及應(yīng)用
        7 展望
        參考文獻(xiàn)
    第二章 動物用基因工程制品的生物安全
        1 基因工程及基因工程制品
        2 生物安全的定義
        3 動物用基因工程制品的安全性
            3.1 對人類和動物健康的作用
            3.2 對生態(tài)環(huán)境的作用
        4 相關(guān)法律法規(guī)的制定
        5 基因工程佐劑制品的安全性評價
        6 結(jié)論
        參考文獻(xiàn)
下篇 研究內(nèi)容
    第三章 自動發(fā)酵罐批量生產(chǎn)重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位
        摘要
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果與分析
            3.1 重組LTB蛋白的酵母表達(dá)
            3.2 重組LTB蛋白的純化
            3.4 純化的重組LTB蛋白特性鑒定
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    第四章 重組LTB在鴨體內(nèi)的消長動態(tài)及其對鴨免疫功能影響的研究
        摘要
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
            3.1 LTB在鴨體內(nèi)的消長動態(tài)研究
            3.2 LTB對鴨免疫功能的影響
        4 討論
            4.1 LTB在鴨體內(nèi)的消長動態(tài)研究
            4.2 LTB對鴨免疫功能的影響
        參考文獻(xiàn)
    第五章 LTB對鴨的安全性研究
        摘要
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
            3.1 LTB基因和抗性標(biāo)記基因殘留檢測
            3.2 LTB誘發(fā)的免疫反應(yīng)檢測
            3.3 LTB對鴨的毒性作用研究
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
附錄
致謝
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【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3627077