豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一種急性、高度傳播性的腸道疾病,該病由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起,以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水等為主要臨床特征。PED于2010年起在中國再次爆發(fā),該次流行主要以變異毒株的出現(xiàn)為特征,造成80%-100%的哺乳仔豬發(fā)病,50%-90%的仔豬死亡。后來該病于2013年5月在美國爆發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失。豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒相關疾病的重要病原,給當前養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失,其靶細胞主要是單核巨噬細胞系統(tǒng)和樹突狀細胞,其感染后主要的臨床組織病變?yōu)榱馨图毎麥p少和炎性細胞浸潤,最終導致機體免疫功能抑制,從而繼發(fā)感染其他細菌和病毒。本論文針對這兩種豬的重要病原,主要研究內(nèi)容如下：1.PEDV的流行病學調(diào)查通過對2011年2月至2011年10月間從華中、華東、華南、西南地區(qū)12個省份的57個豬場采的455份臨床樣品（包括糞便樣品、小腸樣品和乳汁樣品）,用RT-P... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：169 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表(ABBREVIATION)
第1章 文獻綜述
    1.1 豬流行性腹瀉病毒研究進展
        1.1.1 PED的流行
        1.1.2 PEDV的分類地位
        1.1.3 PEDV的分子結構
        1.1.4 5'UTR和3’UTR
        1.1.5 復制酶基因ORF1
        1.1.6 S基因的結構、功能及應用
        1.1.7 M基因的結構與功能
        1.1.8 E基因的結構與功能
        1.1.9 ORF3基因的結構與功能
        1.1.10 N基因的結構與功能
        1.1.11 PEDV的受體研究進展
    1.2 冠狀病毒感染性克隆研究進展
    1.3 豬圓環(huán)病毒研究進展
        1.3.1 豬圓環(huán)病毒概述
        1.3.2 PCV2生物學特性
        1.3.3 PCV2基因組成
        1.3.4 PCV2編碼的蛋白質(zhì)
        1.3.5 PCV2病毒的復制
        1.3.6 PCV2的傳播途徑
        1.3.7 PCV2感染與臨床疾病
        1.3.8 PCV2致病機理
        1.3.9 PCV2與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用
第2章 PEDV CHGDU株感染性克隆的構建
    2.1 研究的目的及意義
    2.2 材料與方法
        2.2.1 病料
        2.2.2 細胞與菌株
        2.2.3 載體與質(zhì)粒
        2.2.4 工具酶及主要試劑
        2.2.5 重要儀器和設備
        2.2.6 培養(yǎng)基配制
        2.2.7 感受態(tài)細胞制備
        2.2.8 分子生物學分析軟件
    2.3 試驗方法
        2.3.1 病料采集與處理
        2.3.2 病毒的分離
        2.3.3 PEDV的增殖
        2.3.4 TCID_(50)的測定
        2.3.5 病毒RNA提取
        2.3.6 引物的設計與合成
        2.3.7 反轉錄合成cDNA
        2.3.8 質(zhì)粒轉染實驗
        2.3.9 間接免疫熒光(IFA)
        2.3.10 RNA定向重組
        2.3.1 1病毒空斑純化
        2.3.12 病毒生長曲線的繪制
        2.3.13 重組病毒對胰蛋白酶依賴性測定
        2.3.14 MLV系統(tǒng)構建穩(wěn)定細胞系Vero-hTMPRSS2-HA篩選
        2.3.15 hTMPRSS2在重組病毒感染過程中的作用
    2.4 實驗結果與分析
        2.4.1 豬流行性腹瀉病毒流行病學調(diào)查
        2.4.2 病毒的分離
        2.4.3 PEDV CHGDU株病毒毒價的測定
        2.4.4 病毒的RT-PCR檢測
        2.4.5 間接免疫熒光實驗(IFA)
        2.4.6 病毒的S基因全長序列測定及分析
        2.4.7 病毒的S基因全長克隆及IFA驗證
        2.4.8 穿梭質(zhì)粒pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP的構建
        2.4.9 重組病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
        2.4.10 重組病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP生長曲線的繪制
        2.4.11 rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP對胰蛋白酶依賴性測定
        2.4.12 穩(wěn)定表達蛋白酶hTMPRSS2的Vero-CCL81細胞系的構建
        2.4.13 蛋白酶TMPRSS2在PEDV感染中的作用測定
    2.5 討論
        2.5.1 PEDV流行病學調(diào)查及CHGDU毒株的分離鑒定
        2.5.2 PEDV CHGDU株S基因全長測序及序列分析
        2.5.3 重組病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
    2.6 小結
第3章 豬圓環(huán)病毒2型感染豬肺泡巨噬細胞轉錄組學研究
    3.1 研究目的及意義
    3.2 材料與方法
        3.2.1 毒株及細胞
        3.2.2 培養(yǎng)基與相關試劑的配制
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 主要儀器
        3.2.5 試驗動物
        3.2.6 肺泡巨噬細胞的分離鑒定
        3.2.7 PCV2感染實驗設計
        3.2.8 肺泡巨噬細胞總RNA的提取
        3.2.9 樣品RNA熒光標記
        3.2.10 芯片的雜交與清洗
        3.2.11 基因芯片掃描
        3.2.12 基因芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析
        3.2.13 芯片結果實時熒光定量PCR分析
        3.2.14 細胞因子檢測
        3.2.15 差異表達基因的互作分析
        3.2.16 統(tǒng)計學分析
    3.3 實驗結果與分析
        3.3.1 感染前仔豬的檢測
        3.3.2 PCV2感染后和qPCR和IFA檢測結果
        3.3.3 樣品RNA質(zhì)量檢測
        3.3.4 芯片雜交結果及差異表達基因GO聚類分析
        3.3.5 差異基因互作網(wǎng)絡分析
        3.3.6 芯片結果qPCR驗證
        3.3.7 PCV2感染后細胞上清中細胞因子檢測
    3.4 討論
        3.4.1 CD74在PCV2感染中的作用
        3.4.2 Toll樣受體通路分析
        3.4.3 MHCII類分子與PCV2感染
        3.4.4 細胞凋亡和生長抑制
        3.4.5 鈣結合蛋白在PCV2感染中的作用
        3.4.6 炎癥反應
    3.5 小結
第4章 結論
參考文獻
附錄
    附錄1 CHGDU毒株S基因核苷酸序列
    附錄2 CHGDU毒株S蛋白氨基酸序列
    附錄3 rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP S基因的氨基酸序列
    附表1 PCV2感染后豬肺泡巨噬細胞差異表達的可注釋的基因
    附表2 差異表達基因生物學進程(GO)分析
個人資料
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒COE核酸疫苗的構建及免疫原性[J]. 向敏,張潔,高其雙,盧順,陳志華,黃海軍,陶弼菲,彭霞,占才耀,夏瑜,童偉文,華娟,王連芳.  中國獸醫(yī)學報. 2013(11)
[2]豬病毒性腹瀉分子流行病學調(diào)查[J]. 劉云波,趙洪翠,王志成,武剛,何啟蓋.  中國畜牧獸醫(yī). 2013(02)
[3]2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點及其防治措施[J]. 張世忠,江斌.  福建畜牧獸醫(yī). 2012(02)
[4]2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J]. 劉孝珍,陳建飛,時洪艷,張鑫,石達,劉勝旺,馮力.  中國預防獸醫(yī)學報. 2012(03)
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[8]豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究[J]. 王鳳,湯德元,李春燕,王彬,張曉杰,甘振磊,劉志杰.  豬業(yè)科學. 2010(12)
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碩士論文
[1]豬鈣結合蛋白S100A9、S100A12在PCV2感染豬腎細胞（PK-15）中的功能研究[D]. 劉羽茜.華中農(nóng)業(yè)大學 2012
[2]豬流行性腹瀉病毒重組沙門氏菌的構建及免疫原性分析[D]. 徐麗麗.華中農(nóng)業(yè)大學 2011
[3]豬病毒性腹瀉多重RT-PCR診斷方法的建立和應用及豬輪狀病毒的分離[D]. 張坤.華中農(nóng)業(yè)大學 2010
[4]豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03株分離鑒定[D]. 張桂紅.東北農(nóng)業(yè)大學 2008



本文編號：3620696